的温度下猝灭；3.将有机层用三批20 %氯化钠水溶液洗 涤（分别320mL、200mL和200mL)。最后一次用氯化钠溶液洗涤后水层的pH是6。该粗产 物的油状产物的HPLC跟踪显示高含量的BA9 (66. 3AUC% )。HPLC分析显示在50-55°C产生 的类似的粗产物中BA9的含量仅58. 6%。此外，两批粗的BA9 (在40°C和在50-55°C生成） 的比较显示在较低温度下生成的批次中副产物的量更少。最引人注意地是HPLC/RRT= 1. 2 的副产物在两个批次中含量的不同。在较高温度下合成的批次中该杂质的含量是9. 6AUC% (见图3A)，而在40°C下生成的粗产物中的含量仅为3. 6AUC% (见图3B)。
[0119] 实施例4:反应规樽放大。
[0120] 因为发现产物和副产物的分布取决于反应混合物的温度，因此在不同规模下研究 了雷帕霉素衍生化过程的温度特性。按照起始的雷帕霉素为30.Og的规模来实施该过程。 在30分钟内分批加入三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯后，内部温度从20°C升至27°C，并进一 步搅拌（仍无内部加热）后升至32°C(从开始加入三氟甲磺酸酯1小时后）。随后，将该 反应混合物外部加热至40°C，并在此温度下搅拌3小时。初始反应后，将2, 6-二甲基吡啶 加入反应混合物中，并在30°C搅拌90分钟。将该反应混合物后处理，得到油状产物。基于 HPLC分析，首次大规模合成产生的粗产物包含64. 2AUC%的BA9和4. 9%的RRT= 1. 2的副 产物。
[0121] 将按照如上文所述方法进行的大规模合成再重复两次，两次都以起始的雷帕霉素 52.Og的规模。合成规模的进一步增加导致在加入三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯后该批次甚 至更大的放热作用（第一次从20升至36°C，第二次从18升至33°C)。从以52g规模合成 的粗的BiolimusA9的HPLC可以明显看出，该粗产物包含62. 9和65. 0AUC%的Biolimus A9以及10. 2和8. 5AUC%的RRT为1. 20的副产物。
[0122] 在以不同的合成规模将三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯加入到反应混合物期间观察 到的起始放热的比较显示，该放热效果的程度与合成的规模成比例（参见表4中对上述合 成的由于放热过程引起的温度升高的比较）。
[0123] 在第一种情况中以2g规模的粗BiolimusA9和以3〇-52g合成的粗BiolimusA9 批次的杂质谱的比较表明，一旦加大合成操作的规模，就会形成更大量的具有RRT= 1. 2的 副产物。对于2g合成的产品，该杂质的量仅为3. 6%，然而对于大规模合成的产物，发现该 杂质的量为4. 9-10. 2AUC%。在不受任何特定理论束缚的情况下，认为该差异是由较低批次 温度在热量不受控制地加入三氟甲磺酸2-乙氧基乙基酯期间升高引起的（小规模时温度 升至25. 5°C，而大规模合成时升至36°C，参见表4)。因此，应当根据反应规模调整控制反应 温度的措施。
[0124]表4.耜BA9的合成规樽和由于与向反应混合物中加入三氟磺酸醅有关的放热引 起的淵度升高稈度之间的关系
[0125]
[0126]实施例5:BiolimusA9的后处理。
[0127] 以2.Og规模的雷帕霉素重复所述合成，最高反应温度仅35°C。唯一的差异是反应 混合物的温度缓慢上升，从25 °C到35°C(在30分钟内，而不是约5分钟，以便进一步最小化 副产物的量）。该合成再次生成粗的BiolimusA9,其具有API的高HPLC/AUC含量（66. 8% ) 和低含量的具有RRT=I. 2(RT= 10. 7min，2. 7% )的副产物。
[0128] 使用硅胶色谱纯化粗产物，采用正己烷和乙酸乙酯的梯度溶剂混合物。用HPLC分 析色谱流分。将具有BA9的HPLC/AUC%多95. 0%并同时符合存在已知和未知杂质的规范 的流分合并。这提供了具有即^：/^1](：纯度=96.2%的纯化849的40%产量。
[0129] 除了纯化的BA9的主要部分外，还从硅胶色谱纯化中获得两个其他显著部分的纯 化BA9:a) 12 %产量的具有HPLC/AUC纯度为91. 8 %的部分和b) 8 %产量的具有HPLC/AUC纯 度为91. 8%的部分。
[0130] 在较大规模（52g规模的雷帕霉素）上使用浅梯度和延长的己烷/乙酸乙酯洗脱 导致了在柱色谱分离期间杂质的差的分辨率。使用正己烷/乙酸乙酯的混合物的浸渍器梯 度。从52g雷帕霉素开始，粗BiolimusA9通过浸渍器梯度硅胶柱色谱的纯化得到了 23. 5g 的纯化产物（HPLC/AUC%纯度为96. 0 % )。获得了额外的10.Og产物（HPLC/AUC纯度为 94.9% ) 〇
[0131]实施例6:反应淵度的小改夺导致了产物分配的令人惊讶的增加
[0132] 发现小的温度改变导致了产物/副产物分配的令人惊奇的改变。对于在60°C和 55°C的合成进行反应混合物取样的比较，如表5和表6所示，表明反应温度的小的降低显著 减少了副产物的形成。这对于保留时间11. 5分钟时洗脱的化合物（一种二取代的杂质） 而言最为明显（60°C反应时RTlL5为12. 5%，而在55°C反应时为5. 9% )。
[0133] 表5.包含雷帕霍素、二氯甲烷、Huenig碱和三氟甲磺酸2-乙氣基乙基醅的反应 混合物在60°C讲行80分钟的取样结果
[0134]
[0136] 因此，通过将反应在仅低5°C的温度下进行相同的持续时间，出现了雷帕霉素原料 向BA9的改善的转化（在60°C反应的BA9为39. 8%，而在55°C反应的BA9为70. 2% )。抑 制副产物的形成是特别有利的，因为这些副产物尤其难以从产物混合物中除去。相反，未反 应的原料容易除去。因此，本文所述的方法显著增加了纯化产物的产率，降低成本并减少与 目前已知的方法有关的困难。
[0137] 表6.包含雷帕霍素、二氯甲烷、Huenig碱和三氟甲磺酸2-乙氣基乙基醅的反应 混合物在55°C讲行80分钟的取样结果。
[0138]
[0140] 尽管为了清楚和理解的目的，上文已经通过举例说明和实施例进行了一定程度的 详细描述，但是本领域技术人员应当理解，在所附权利要求的范围内能够进行某些改变和 修饰。此外，本文提供的各篇文献整体引入本文作为参考，其程度就如同将各篇文献各自单 独引入本文一样。
【主权项】
1.获得具有式I结构的化合物的方法：该方法包括： a) 将有机溶剂、具有氮杂原子的有机碱化合物、具有式II结构的化合物以及具有式 III结构的化合物混合在反应混合物中，b) 将反应混合物的温度保持在约25 °C至约55°C;并且 c) 从反应混合物中分离具有式I结构的化合物； 其中 R1选自Ra- (0)d-Rb的基团，其中R3是C: 5亚烷基且Rb是C: 5烷基；C: 5亚烷基-OH;C6 1(] 芳基Q5烷基；C6i。芳基Ci5烷氧基；Ci5烷氧基Ci5烷基；酰基；酰基Ci5烷基；氨基Ci5烧 基；Q5烷基氨基Ci5烷基；酰基氨基Ci5烷基；Ci5烷氧基羰基氨基Ci5烷基；和C6i。芳基； R2是氢；且 下标d是选自0-1的整数； 由此获得具有式I结构的化合物。2. 如权利要求1所述的方法，其中具有式I结构的化合物是3. 如权利要求1所述的方法，其中具有式II结构的化合物是雷帕霉素。4. 如权利要求1所述的方法，其中R1是CH2-CH2-0H。5. 如权利要求1所述的方法，其中R1是（CH丄-0-(CH2)f-H，e是选自1-5的整数，且f 是选自1-5的整数。6. 如权利要求5所述的方法，其中R1是CH2-CH2-0-CH2-CH3。7. 如权利要求5所述的方法，其中e和f的总和不大于7。8. 如权利要求1所述的方法，其中具有氮杂原子的有机碱化合物具有式IV的结构，其中1?%1^、『、1^和1^各自独立的选自11、(：15烷基、011和順2。9. 如权利要求1所述的方法，其中具有氮杂原子的有机碱化合物是选自2, 6-二甲基吡 啶和N，N-二异丙基乙胺。10. 如权利要求1所述的方法，其中具有氮杂原子的有机碱化合物是2, 6-二甲基吡啶。11. 如权利要求1所述的方法，其中在（b)部分保持约2-10小时。12. 如权利要求11所述的方法，其中在（b)部分中温度保持在约25°C至约40°C。13. 如权利要求1所述的方法，其中有机溶剂是甲苯或二氯甲烷。14. 如权利要求1所述的方法，其中具有式III结构的化合物与具有式II结构的化合 物的摩尔比是从约30比1至约60比1。15. 如权利要求1所述的方法，其中具有氮杂原子的有机碱化合物与具有式II结构的 化合物的摩尔比是从约80比1至约120比1。16. 如权利要求15所述的方法，其中所述比例是104比1。17. 如权利要求1所述的方法，其中具有氮杂原子的有机碱化合物是分两批加入。18. 如权利要求1所述的方法，其中分离具有式I结构的化合物包括使用色谱法。19. 如权利要求18所述的方法，其中所述色谱法是选自硅胶柱色谱、高压液相色谱和 薄层色谱。20. 如权利要求19所述的方法，其中所述色谱法是硅胶柱色谱，且其中该色谱法是通 过使用包含一种或多种选自乙酸乙酯、己烷和庚烷的溶剂的流动相来进行。21. 如权利要求1所述的方法，其进一步包括固化具有式I结构的化合物。22. 如权利要求21所述的方法，其中固化具有式I结构的化合物包括： a) 将具有式I结构的化合物溶于甲醇中，并且 b) 从水中沉淀具有式I结构的化合物； 从而固化具有式I结构的化合物。
【专利摘要】本发明提供了获得包括Biolimus？A9在内的雷帕霉素衍生物的改进的方法。
【IPC分类】C07D498/00, A01N43/42
【公开号】CN105102463
【申请号】CN201480005663
【发明人】M·W·卡约, R·S·福尼科拉, I·科瓦奇克
【申请人】生物传感器国际集团有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年1月21日
【公告号】CA2898723A1, EP2948460A1, US20150322086, WO2014116611A1