化钠调节pH至8. 0,保持柱子温度为20-25°C;流 速为12ml/min;检测波长为280nm。
[0069] 具体步骤为：
[0070] (1)采用平衡液平衡柱子4CV;
[0071] (2)约含3100mg重组人胰岛素前体的稀释溶液上样，上样结束继续采用平衡液平 衡 4CV;
[0072] (3)采用洗涤液A洗涤4CV，收集洗涤液；
[0073] (4)采用洗涤液B洗涤4CV;
[0074] (5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；
[0075] (6)称取15mg胰蛋白酶加入洗脱峰中混勾，30°C酶切1. 5小时。
[0076] 粗样样品的上样量约60g/L床层体积。实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为 14. 3%，含量约为3100mg;洗涤液A收集样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗涤液B洗涤不 出峰；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为97. 8%，目的蛋白含量约2980mg，胰岛素前 体酶切1. 5小时后酶切转化率达95. 5%。
[0077] 说明根据实施例3的方法，纯化后重组人胰岛素前体纯度达到96. 9%，样品收率 为96. 1%，胰岛素前体酶切转化率达95. 5% (图2)。
[0078] 实施例4重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法
[0079] 上样样品为预备实施例1的发酵上清，发酵上清用去离子水稀释至原体积的5倍。 称取适量琥珀酸溶入稀释样品至终浓度为〇.Olmol/L。
[0080] 离子层析纯化方法采用Source30S(XK26/200, 50ml)在层析工作站上进行；平 衡液为 〇? 〇lmol/L琥珀酸 +0? 01mol/LNaCl，洗涤液A为 0? 01mol/L琥珀酸 +0? 12mol/L NaCl，洗涤液B为lmmol/L盐酸，洗脱液为0. 05mol/L碳酸氢铵缓冲液；
[0081] 除洗脱液外所有溶液（包括上样样品、平衡液、洗涤液A、洗涤液B)用盐酸或氢氧 化钠调节pH至2. 0,洗脱液用盐酸或氢氧化钠调节pH至7. 0,保持柱子温度为20-25°C;流 速为4ml/min;检测波长为280nm。
[0082] 具体步骤为：
[0083] (1)采用平衡液平衡柱子4CV;
[0084] (2)约含3100mg重组人胰岛素前体的稀释溶液上样，上样结束继续采用平衡液平 衡 4CV;
[0085] (3)采用洗涤液A洗涤4CV，收集洗涤峰；
[0086] (4)采用洗涤液B洗涤4CV;
[0087] (5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；
[0088] (6)称取8mg胰蛋白酶加入洗脱峰中混勾，20°C酶切3小时。
[0089] 粗样样品的上样量约60g/L床层体积。实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为 14%，含量约为3100mg;洗涤液A收集样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗涤液B洗涤时不 出峰；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为94%，目的蛋白含量约3000mg，胰岛素前体 酶切后酶切转化率为90%。
[0090] 实施例5重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法
[0091] 上样样品为预备实施例1的发酵上清，发酵上清用去离子水稀释至原体积的20 倍。称取适量磷酸溶入稀释样品至终浓度为〇. 〇5mol/L。
[0092] 离子层析纯化方法采用Source15S(XK26/200, 50ml)在层析工作站上进行；平 衡液为 〇? 2mol/L磷酸 +0? 12mol/LNaCl，洗涤液A为 0? 2mol/L磷酸 +0? 2mol/LNaCl，洗涤 液B为5mmol/L盐酸，洗脱液为0. 3mol/L硼酸缓冲液；
[0093] 除洗脱液外所有溶液（包括上样样品、平衡液、洗涤液A、洗涤液B)用盐酸或氢氧 化钠调节pH至4. 5,洗脱液用盐酸或氢氧化钠调节pH至9. 0,保持柱子温度为20-25°C;流 速为10ml/min;检测波长为280nm。
[0094] 具体步骤为：
[0095] (1)采用平衡液平衡柱子4CV;
[0096] (2)约含3100mg重组人胰岛素前体的稀释溶液上样，上样结束继续采用平衡液平 衡 4CV;
[0097] (3)采用洗涤液A洗涤4CV，收集洗涤峰；
[0098] (4)采用洗涤液B洗涤4CV;
[0099] (5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；
[0100] (6)称取31mg胰蛋白酶加入洗脱峰中混勾，40°C酶切0. 5小时。
[0101] 粗样样品的上样量约60g/L床层体积。实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为 14%，含量约为3100mg;洗涤液A收集样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗涤液B洗涤时不 出峰；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为93%，目的蛋白含量约3000mg，胰岛素前体 酶切后酶切转化率为91 %。
[0102] 实施例6重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法
[0103] 上样样品为预备实施例1的发酵上清，发酵上清用去离子水稀释至原体积的10 倍。称取适量乙酸溶入稀释样品至终浓度为0. 〇5mol/L。
[0104] 离子层析纯化方法采用CMSepharoseFF(XK26/200, 50ml)在层析工作站上进 行；平衡液为 〇. 〇5mol/L乙酸 +0. 12mol/LNaCl，洗涤液A为 0. 05mol/L乙酸 +0. 2mol/L NaCl，洗涤液B为3mmol/L盐酸，洗脱液为0. 05mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris)缓冲液；
[0105] 除洗脱液外所有溶液（包括上样样品、平衡液、洗涤液A、洗涤液B)用盐酸或氢氧 化钠调节pH至3. 0,洗脱液用盐酸或氢氧化钠调节pH至7. 8,保持柱子温度为20-25°C;流 速为16ml/min;检测波长为280nm。
[0106] 具体步骤为：
[0107] (1)采用平衡液平衡柱子4CV;
[0108] (2)约含3100mg重组人胰岛素前体的稀释溶液上样，上样结束继续采用平衡液平 衡 4CV;
[0109] (3)采用洗涤液A洗涤4CV，收集洗涤峰；
[0110] ⑷采用洗涤液B洗涤4CV;
[0111] (5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；
[0112] (6)称取15mg胰蛋白酶加入洗脱峰中混勾，30°C酶切1小时。
[0113] 粗样样品的上样量约60g/L床层体积。实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为 14%，含量约为3100mg;洗涤液A收集样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗涤液B洗涤时不 出峰；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为93%，目的蛋白含量约3000mg，胰岛素前体 酶切1小时后酶切转化率为90 %。
[0114] 对比实施例1重组人胰岛素前体的纯化和酶切
[0115] 上样样品为预备实施例1的发酵上清，发酵上清用去离子水稀释至原体积的10 倍，称取适量柠檬酸溶入稀释样品至终浓度为20mmol/L。
[0116] 离子层析纯化方法采用CMSepharoseFF(XK26/200, 50ml)在层析工作站上进 行；平衡液为20mmol/L梓檬酸+0? 01mol/LNaCl，洗涤液为20mmol/L梓檬酸+0?lmol/L NaCl，洗脱液为20mmol/L柠檬酸+0. 5mol/LNaCl;所有溶液用盐酸或氢氧化钠调节pH至 4. 0,保持柱子温度为20-25°C;流速为12ml/min;检测波长为280nm。
[0117] 具体步骤为：
[0118] (1)采用平衡液平衡柱子4CV;
[0119] (2)约含3100mg重组人胰岛素前体的稀释溶液上样，上样结束继续采用平衡液平 衡 4CV;
[0120] (3)采用洗涤液洗涤4CV，收集洗涤峰；
[0121] (5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；
[0122] (6)根据洗脱收集液体积，称取适量的碳酸氢铵，逐步加入洗脱液中，边搅拌边加 至完全溶液，使溶液中碳酸氢铵的终浓度为0.lmol/L，调节pH为8. 0。
[0123] (7)称取15mg胰蛋白酶加入（6)的溶液中混勾，30°C酶切1. 5小时。
[0124] 实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为14. 3%，含量约为3100mg;洗涤液洗涤收集 样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为92. 1%，目的蛋 白含量约2824mg。此时重组人胰岛素前体纯度达到92. 1 %，样品收率为91. 1 %。
[0125] 将洗脱收集液调整至合适的缓冲环境及pH值后进行酶切，酶切转化率约60%。 分析原因，可能是原洗脱液中的盐浓度较高，对胰蛋白酶的活性有影响，延长酶切时间无好 转。
[0126] 根据对比实施例1的方法，纯化后重组人胰岛素前体纯度达到92. 1% (图1)，样 品收率为91. 1%，酶切转化率约60% (图2)。
[0127] 对比实施例2重组人胰岛素前体的纯化和酶切
[0128] 上样样品为预备实施例1的发酵上清，发酵上清用去离子水稀释至原体积的10 倍，称取适量柠檬酸溶入稀释样品至终浓度为20mmol/L。
[0129] 离子层析纯化方法采用CMSepharoseFF(XK26/200, 50ml)在层析工作站上进 行；平衡液为20mmol/L梓檬酸+0? 01mol/LNaCl，洗涤液为20mmol/L梓檬酸+0?lmol/L NaCl，洗脱液为20mmol/L柠檬酸+0. 5mol/LNaCl，所有溶液用盐酸或氢氧化钠调节pH至 4. 0,保持柱子温度为20-25°