C;流速为12ml/min;检测波长为280nm。
[0130] 具体步骤为：
[0131] (1)采用平衡液平衡柱子4CV;
[0132] (2)约含3100mg重组人胰岛素前体的稀释溶液上样，上样结束继续采用平衡液平 衡 4CV;
[0133] (3)采用洗涤液洗涤4CV，收集洗涤峰；
[0134] (5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；
[0135] (6)根据洗脱收集液体积，按照硫酸铵饱和度60 %的比例称取适量的硫酸铵，研 磨后逐步加入洗脱液中，边搅拌边加至完全溶液。
[0136] (7)硫酸铵沉淀样品静置4小时后离心，离心条件：4°C，lOOOOrpm，离心30min，弃 上清。
[0137] (8)离心沉淀样品用适量浓度为0.lmol/L，pH8. 0的碳酸氢铵缓冲液溶解，使胰岛 素前体的浓度与实施例1中洗脱样品浓度一致。
[0138] (9)称取15mg胰蛋白酶加入⑶的溶液中混勾，30°C酶切1. 5小时。
[0139] 实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为14. 3%，含量约为3100mg;洗涤液洗涤收集 样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为92. 3 %，目的蛋 白含量约2832mg。此时重组人胰岛素前体纯度达到92. 3%，样品收率为91. 4%。
[0140] 由于直接转换洗脱液环境会导致酶切转化率骤降，因此通过硫酸铵沉淀离心再溶 解的步骤来进行换相，重组人胰岛素前体蛋白硫酸铵沉淀离心得率为95%，再溶解后酶切 转化率约85%，此时的酶切转化率高于对比实施例1，低于实施例1-3。分析原因，可能是硫 酸铵沉淀会导致胰岛素前体蛋白沉淀再溶解的溶液环境仍有少量的硫酸铵成分，对胰蛋白 酶的活性有影响。
[0141] 根据对比实施例2的方法，纯化后重组人胰岛素前体纯度达到92. 3%，纯化步骤 与沉淀步骤的总收率为86. 8%，酶切转化率约85% (图2)。
[0142] 实施例1与对比实施例1、2的对比结果见表1。
[0143] 表1对比实施例的结果对比
[0144]
[0145] 对比实施例3重组人胰岛素前体的纯化和酶切
[0146] 上样样品为预备实施例1的发酵上清，发酵上清用去离子水稀释至原体积的10 倍，称取适量乙酸溶入稀释样品至终浓度为50mmol/L。
[0147] 离子层析纯化方法采用CMSepharoseFF(XK26/200, 50ml)在层析工作站上进 行；平衡液为 50mmol/LNaAC-HAC，洗涤液为 50mmol/LNaAC-HAC+0.lmol/LNaCl，洗脱液为 50mmol/LNaAC-HAC+0. 5mol/LNaCl;所有溶液用盐酸或氢氧化钠调节pH至4. 0,保持柱子 温度为20-25°C;流速为12ml/min;检测波长为280nm〇
[0148] 具体步骤为：
[0149] (1)采用平衡液平衡柱子4CV;
[0150] (2)约含3100mg重组人胰岛素前体的稀释溶液上样，上样结束继续采用平衡液平 衡 4CV;
[0151] (3)采用洗涤液洗涤4CV，收集洗涤峰；
[0152] (5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；
[0153] (6)将洗脱收集液溶解于pH为8. 5, 25mmol/LTris-HCL缓冲液中，加入15mg胰蛋 白酶混匀，30°C酶切1. 5小时。
[0154] 实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为14. 3%，含量约为3100mg;洗涤液洗涤收集 样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为92%，样品收率 为90. 5 %。将洗脱收集液调整至合适的缓冲环境及pH值后进行酶切，酶切转化率约63 %。
【主权项】
1. 一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，包括：（1)将阳离子离子层析柱用 平衡液进行平衡；（2)将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清上平衡后的阳离子离子 层析柱，依次用平衡液进行平衡、用洗涤液进行洗涤和用洗脱液进行洗脱；收集洗脱产物， 得到纯化的重组人胰岛素前体；(3)将纯化的重组人胰岛素前体用胰蛋白酶进行酶切转 换，得到缺少B链第30位苏氨酸的人胰岛素；其特征在于：所述洗脱液的pH值为7. 0-9. 0， 优选为7. 8-8. 5,更优选为8. 0-8. 5。2. 按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗脱液为碳酸氢铵 缓冲液、硼酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的任意一种。3. 按照权利要求2所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗脱液的浓度为 0? 05-0. 3mol/L ;优选的，所述洗脱液的浓度为0? 1-0. 15mol/L〇4. 按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：步骤（2)中所述洗涤为 用洗涤液A进行洗涤；所述洗涤液A包括：缓冲液和无机盐；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲 液、乙酸缓冲液、梓檬酸缓冲液或琥珀酸缓冲液中的任意一种；所述无机盐为氯化钠； 优选的，所述缓冲液的浓度为〇. 01-0. 2mol/L，更优选为0. 01-0. 05mol/L，最优选 为20mmol/L ;所述无机盐的浓度为0? 01-0. 2mol/L，优选为0? 01-0. 12mol/L，最优选为 0?lmol/L〇5. 按照权利要求4所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：用洗涤液A洗涤后，再接 着用洗涤液B洗涤阳离子层析柱；其中，所述洗涤液B为盐酸； 优选的，所述洗涤液B为l-5mmol/L盐酸；最优选为5mmol/L盐酸。6. 按照权利要求4或5所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗涤液A或洗 涤液B的pH值为2. 0-4. 5,优选为3. 0-4. 0,更优选为3. 5-4. 0,最优选为4. 0。7. 按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：步骤（1)或步骤（2)中 所述的平衡液包括：缓冲液和无机盐；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬 酸缓冲液或琥珀酸缓冲液中的任意一种或多种；所述无机盐为氯化钠；优选的，所述缓冲 液的浓度为〇? 01-0. 2mol/L，更优选为0? 01-0. 05mol/L，最优选为20mmol/L ;所述无机盐的 浓度为 〇? 01-0. 12mol/L，优选为 0? 01-0. lmol/L，最优选为 0? Olmol/L ; 更优选的，所述平衡液的pH值为2. 0-4. 5,优选为3. 0-4. 0,更优选为3. 5-4. 0,最优选 为 4. 0 ; 步骤（3)中胰蛋白酶的加入量为：按照质量比计，胰蛋白酶：重组人胰岛素前体= 1:100-1:400 ;优选为 1:200 ; 所述酶切的温度为20-40°C ;酶切的时间为0. 5-3小时； 优选的，所述酶切的温度为25-30°C ;酶切的时间为1-1. 5小时； 最优选的，所述酶切的温度为30°C ;酶切的时间为1. 5小时。8. 按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述阳离子离子层析柱 的离子交换填料为 S Sepharose FF、SP Sepharose FF、CM Sepharose FF，Source 15S 或 Source 30S 中的任意一种；优选为 CM Sepharose FF ; 所述阳离子离子层析柱的温度为20-25 °C ;所述洗涤液或洗脱液的线性流速为 7. 5_30mm/min，优选为 22. 6mm/min〇9. 按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述的分泌表达的重组 人胰岛素前体的发酵上清为编码重组人胰岛素前体的基因在真核细胞中进行分泌表达获 得的发酵上清；优选的，所述的分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清为编码重组人胰 岛素前体的基因在毕赤酵母细胞中进行分泌表达获得的发酵上清。10.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：将分泌表达的重组 人胰岛素前体的发酵上清进行预处理后再上平衡后的阳离子离子层析柱；其中，所述预 处理包括：将发酵上清稀释，加入缓冲剂，使发酵上清与平衡液具有相同的缓冲盐浓度和 PH值；其中，所述缓冲剂为磷酸、乙酸、柠檬酸或琥珀酸中的任意一种；所述缓冲盐浓度为 0? 01-0. 2mol/L，优选为 0? 01-0. 05mol/L，最优选为 20mmol/L ;所述 pH 值为 2. 0-4. 5,优选 为3. 0-4. 0,更优选为3. 5-4. 0,最优选为4. 0 ;所述稀释为稀释5-20倍，优选为稀释10倍； 更优选为，用去离子水或注射用水进行稀释。
【专利摘要】本发明公开了一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，属于重组人胰岛素及其类似物的制备领域。本发明将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清用阳离子层析柱进行纯化，在层析的洗涤时先后采用两种不同洗涤液进行洗涤，更快速的进行目的蛋白的洗脱，缩短洗脱时间，减少目的蛋白沉淀，同时减少洗脱样品体积；在洗脱时采用pH值7.0-9.0的洗脱液进行洗脱，洗脱后的产物不需进行换相操作，直接加入胰蛋白酶进行酶切转换，转换效率高。本发明方法操作简单，经过一步离子层析纯化完成对发酵液上清的粗纯化和换相操作，能够将样品纯度从14％提高至95％，且纯化后的样品直接进行酶切，酶切转换效率在95％以上，简化生产工艺，节约成本。
【IPC分类】C12P21/06, C07K1/18, C07K14/62
【公开号】CN105111304
【申请号】CN201510645026
【发明人】刘海峰, 周祥山, 应欢, 张元兴, 田守生, 解福生, 方喆, 黄菁, 庞甲佩, 史兆松
【申请人】山东阿华生物药业有限公司, 东阿阿胶股份有限公司, 华东理工大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月30日