3(]03。确认实施例4制备的化合物为所述的二萜类化 合物 14-氧-对映-8 (9)，15-海松二稀酸（14-〇x〇-ent_pimara-8 (9)，15-diene_19-〇ic acid) 〇
[0040] 实施例10 取实施例5制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果 为：其结构同实施例6,分子式为C2(]H3(]03。确认实施例5制备的化合物为所述的二萜类化 合物 14-氧-对映-8 (9)，15-海松二稀酸（14-〇x〇-ent_pimara-8 (9)，15-diene_19-〇ic acid) 〇
[0041] 实施例11 本发明化合物抗炎活性检测 取实施例1~5所制备的任一二萜类化合物进行抗炎活性检测试验，试验情况如下： 采用LPS诱导RAW264. 7细胞产生N0的筛选模型评价本发明化合物对N0生成的抑制 作用： ⑴试剂的配制：D-Hank's缓冲溶液：称取NaCl8.0g、KCl0.4g、Na2HP04*12H20 0. 134g、KH2P04 0 . 06g、NaHC03 0. 35g、酚酞 0. 02g，加入超纯水约 800mL使全溶，调节 PH至7. 0-7. 2,超纯水定容至1L，过滤，分装，湿热（121 °C、20min)灭菌，4 °C贮存备用。
[0042]PBS缓冲溶液：称取NaCl8. 0g、KC1 0? 2g、KH2P04 0? 27g、Na2HP04*12H20 3. 58 g，加入超纯水约800mL使全溶，调节pH至7. 2-7. 4,超纯水定容至1L，过滤，分装，湿热灭 菌，4 °C贮存备用。
[0043] 胰酶：胰酶1. 25g、EDTA-Na2 0. 1g，用PBS缓冲溶液定容至500mL，所有操作在 冰上完成。
[0044] 化合物母液：化合物以DMS0为溶剂配制成100mmol/L的母液，-20 °C贮存。
[0045](2)接种细胞：取处于对数生长期的小鼠巨噬细胞（RAW264. 7)，用含10%胎牛血 清的DMEM培养液制成细胞悬液，以8*104/孔接种于96孔板，每孔100yL，于恒温培养箱培 养 24h。
[0046](3)加入待检测化合物：实验分为空白组（DMS0+培养液）、LPS组（LPS+DMS0+培 养液）、阳性药物组（L-NMMA+LPS+DMS0+培养液）和化合物组（不同剂量化合物+LPS+培养 液），化合物组分为l〇〇、25、6. 25、1. 56、0. 39yM五个剂量组；小心吸出残留培养液后，根 据不同分组分别给予不同的试剂和培养液，总体积100yL;每组设置3个复孔，各组DMS0 含量均控制在1%。。继续培养24h。
[0047] (4)NO含量检测：小心吸取上清液50L，加入Griessr液50L，于摇床振摇10min， 再加入GriessII液50yL，继续振摇10min，在全波长酶联免疫检测仪540nm处读取吸 光值，根据N0厂含量标准曲线（按照Griess试剂盒说明书制作）计算出N0含量。运用IBM SPSSStatistics21和GraphPadPrism5对数据进行单因素方差分析、计算IC5。等。
[0048] 计算得本发明化合物对LPS诱导RAW264. 7细胞产生N0的半数抑制浓度为8. 9 土 1.6吨/mL(阳性对照L-单甲基精氨酸（L-NMMA)，IC5。为3. 3 ± 0. 7吨/mL)，表明本发明 的化合物具有较好的抗炎活性。
[0049] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种二萜类化合物，其特征在于所述的二萜类化合物是以黑果土当归根为原 料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分 子式为C2QH3Q03，命名为 14-氧-对映-8 (9)，15-海松二稀酸（14-oxo-ent-pimara -8 (9)，15-diene_19-〇icacid)，具有下述结构式：2. -种权利要求1所述的二萜类化合物的制备方法，其特征在于是以黑果土当归根为 原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为： A、 浸膏提取：将黑果土当归根晾干粉碎得到0. 05~0. 15cm粒径大小的颗粒，加入黑果 土当归根重量比4~8倍的体积百分浓度80~95%乙醇溶液于65~74°C下回流提取3~5次，每 次l~3h，合并提取液，提取液过滤，减压浓缩提取液至比重为I. 1~1. 3得到浸膏a; B、 有机溶剂萃取：浸霄a中加入重量比2~4倍量的水，依次用与水等体积的石油醚、乙 酸乙酯和正丁醇溶剂进行萃取，每种溶剂萃取4~6次，蒸去溶剂分别得到石油醚萃取物b、 乙酸乙酯萃取物c和正丁醇萃取物d; C、 硅胶柱层析： 1) 将石油醚萃取物b上硅胶柱，装柱硅胶为100~200目，用量为萃取物b重量6~8倍 量；用体积比为25:1~0:1的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩， 经TLC监测，合并相同的部分； 2) 将1)中以5:1配比的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液e上硅 胶柱，装柱硅胶为200~300目，用量为洗脱液e体积6~8倍量；用体积比15:1~0:1的石油 醚-乙酸乙酯有机溶剂梯度洗脱、浓缩，经TLC检测，合并相同的部分； D、 高效液相色谱分离：将C步骤2)中以2:1配比的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂 进行洗脱得到的洗脱液采用半制备高效液相色谱仪分离纯化，即得所述的二萜类化合 物 14-氧-对映-8 (9)，15-海松二稀酸（14-〇x〇-ent_pimara-8 (9)，15-diene_19-〇ic acid) 〇3. 根据权利要求2所述的二萜类化合物的制备方法，其特征在于A步骤所述的过滤是 经80~120ym的滤纸进行过滤。4. 根据权利要求2所述的二萜类化合物的制备方法，其特征在于A步骤所述的减压浓 缩是在50°C以下的温度条件下用旋转蒸发仪进行减压浓缩。5. 根据权利要求2所述的二萜类化合物的制备方法，其特征在于B步骤中所述的蒸去 溶剂是采用旋转蒸发仪蒸去溶剂。6. 根据权利要求2所述的二萜类化合物的制备方法，其特征在于C步骤I)中所述的石 油醚-乙酸乙酯有机溶剂的体积配比为25:1、20:1、15 :1、10:1、7:1、5:1、2:1和0:1。7. 根据权利要求2所述的二萜类化合物的制备方法，其特征在于C步骤2)中所述的石 油醚-乙酸乙酯有机溶剂的体积配比为15:1、10:1、7 :1、5:1、2:1和0:1。8. 根据权利要求2所述的二萜类化合物的制备方法，其特征在于将C步骤中以2:1配 比的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液经半制备高效液相色谱，以体积配 比为50:50的甲醇-水为流动相，流速2.51111/111111，250 \10_，5 11111的(：18为固定 相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50yL，收集34~36min的色谱峰，多次累加后 蒸干，得到所述的二砲类化合物14-氧-对映-8 (9)，15-海松二稀酸（14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oicacid)。9. 一种权利要求1所述的二萜类化合物在制备预防和/或治疗炎症药物中的应用。10. 根据权利要求9所述的二萜类化合物在制备预防和/或治疗急慢性炎症药物中的 应用。
【专利摘要】本发明公开了一种二萜类化合物及其制备方法与应用，所述的二萜类化合物是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C20H30O3，命名为14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸(14-oxo-ent-pimara-8(9),15-diene-19-oic？acid)，具有下述结构式：。所述制备方法是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得。所述的应用为所述的二萜类化合物在制备预防和/或治疗抗炎药物中的应用。本发明所述的二萜类化合物进行了体外抗炎活性测试，实验结果显示出良好的抑制脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞(RAW264.7)产生一氧化氮(NO)的作用，可为医用工业提供有应用价值的新化合物或先导化合物。
【IPC分类】A61P29/00, C07C51/42, C07C62/38
【公开号】CN105130796
【申请号】CN201510687706
【发明人】黄相中, 李艳红, 江志勇, 孙静贤, 夏福婷
【申请人】云南民族大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年10月22日