）的SolutionI;
[010引 （3) 16 °C反应30分钟；
[0109] 注：①室溫（25°C)也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低；②5分钟也能 正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
[0110] (4)全量（10y1)加入至100y1JM109感受态细胞中冰中放置30分钟；
[0111] (5) 42°C加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟；
[0112] (6)加入890y1S0C培养基，37 °C振荡培养60分钟；
[0113](7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的k琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，计数白色、 蓝色菌落；
[0114] 做挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小；
[0115] 使用ControlInsed时的连接/转化结果如表1，使用的感受态细胞的转化效率 为：1. 5XlOScfu/y邑；
[0116]PUC19DNA
[0117]表1
[011引
[0119] *效率是指白色菌落中的目的DMInsed片段的连入效率。
[0120] 利用从标本中分离培养出纳米细菌的菌液，根据基因库中纳米细菌leSrRNA基因 序列设计引物，扩增出特异性片段，经过胶回收、T载体克隆、基因测序和比对。
[0121] 转化的质粒送大连宝生物工程公司进行核巧酸测序，特异性片段的测序结果经软 件与纳米细菌的leSrRNA序列进行比较后发现相似度为98%。测序及比照结果：
[0123]Score= 2480bits(1290),Expect= 0.Oldentities= 1387/1409(98 %),Gaps =4/1409 (0%)，Strand=Plus/Plus。
[0124] 结果发现获得的特异性片段与基因库中的纳米细菌的leSrRNA基因高度一致： Identities= 1387/1409(98%)，Gaps= 4/1409(0% )。从而证实从培养液中提取出的特 异性片段即是纳米细菌的leSrRNA，也又一次证实纳米细菌是有生命的微生物。
[0125] W上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用W限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种纳米细菌16sRNA基因的鉴定方法，其特征在于，所述的纳米细菌16sRNA基因的 鉴定方法包括： 步骤一、根据纳米细菌16SRNA基因序列设计一对引物如下： 5，一aac邑aac邑act邑邑邑邑C邑邑Ca邑邑C-3，；5，一cacccca邑tc邑Ct邑accc-3， ? 弓I串勿月巧，Primer Name：A,LotNo：AW09639,TM：66. 00；PrimerName：B,LotNo：AW09640,TM：64. 13 ； 步骤二、提取纳米细菌全基因组DM,具体包括： (1) 制备菌液，用于提取纳米细菌全基因组DNA的菌液有S种不同的来源：①从III型前 列腺炎患者EPS中获得；②从前列腺结石中获得；③从标本的培养液中获得； (2) 按TIANDZ公司细菌DNAOUT使用手册VI. 3进行操作； 步骤S、用合成的引物进行PCR扩增； 步骤四、回收特异性扩增片段； 步骤五、扩增片段克隆到PMD-18T; 步骤六、转化的质粒进行核巧酸测序，将测序结果与纳米细菌16SRNA序列进行比较， 鉴定新分罔的纳米细困。2. 如权利要求1所述的纳米细菌16SRNA基因的鉴定方法，其特征在于，=种不同来源 的菌液的制备方法分别为： (1) 取Im化PS，用生理盐水稀释5倍，经0. 45um滤器过滤，4°C离屯、40min(20，000Xg)， 弃上清，留取管底Iml混匀，再用无菌生理盐水稀释5倍，经0.22um滤器过滤，4°C离屯、 40min(20,000Xg)，弃上清，留取管底沉淀，加入1当量盐酸0. 5ml混匀，37°C放置30min; 加入IMTris0. 5ml中和，22000g离屯、40min，留沉淀备用； (2) 手术中无菌采取患者的结石标本，在IN肥1中浸泡30min，W去除矿物质，加入 0. 5MTris进行中和，娠碎结石，用生理盐水配成5 %浓度，用0. 22ym滤膜过滤，4°C离屯、 40min(20000Xg),留沉淀备用； (3) 标本培养4周后，培养管底部出现白色菌群沉淀，将培养管中的培养基大部分弃 去，留取管底部分lOOul，彻底混匀后，移入离屯、管中，加入生理盐水，22000g离屯、40min; 去上清，沉淀中加入1当量盐酸0.5ml混匀，37°C放置30min;加入IMTris0.5ml中和， 22000g离屯、40min，留沉淀备用。3. 如权利要求1所述的纳米细菌16SRNA基因的鉴定方法，其特征在于，步骤四和步骤 五的具体方法为： (1) 如果试剂盒内的溶液A和溶液B产生沉淀，需要65°C预热沉淀溶解，摇匀待用； (2) 将0. 1-1. 5血过夜培养的菌液转移到1. 5血塑料离屯、管中，室溫12000-15000g离 屯、1分钟沉淀细菌，弃上清； (3) 加入600yL溶液A到细菌沉淀中，吹打均匀； (4) 加入ISOiiL溶液B到离屯、管中，颠倒数次混匀后溶液中将有白色丝状悬浮物产生， 溶液B比较粘稠，在天平上称取150-160mg，将ImL枪头剪去一截再吸取； (5) 室溫放置3-5分钟，放置在65°C; (6) 加入200yL自备氯仿，震荡混匀10-30秒，溶液将呈乳白色； (7) 12000-15000g室溫离屯、2分钟，上清透明，中间层有白膜，小屯、转移上清到新的 1. 5mL塑料离屯、管中，避免触及中间层的白膜； (8) 在750yL上清液中加入I倍体积的异丙醇，用手上下颠倒30秒混匀，将有絮状DNA 沉淀出现，室溫下12000-15000g离屯、3分钟，弃上清，管底将有微小DNA沉淀； (9) 沉淀用1血75%乙醇清洗2次后，短暂离屯、，吸弃残留的液体50iiL，加入 50-100yL自备的TE缓冲液溶解DNA沉淀； (10) 在第4步没有加RNaseA，或加后还有残留的RNA污染，加入5-15yLRNaseA溶 液，37°C保溫30分钟，直接取5-10yL电泳检测DNA，如果需要测OD，则将降解的RNA通过 乙醇沉淀去除。4. 如权利要求1所述的纳米细菌16SRNA基因的鉴定方法，其特征在于，用合成的引物 进行PCR扩增，具体包括： (1)PCR反应体系：(2) PCR反应条件：(3) 结果检测：反应结束后取5y1反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。5. 如权利要求1所述的纳米细菌16SRNA基因的鉴定方法，其特征在于，步骤四回收特 异性扩增片段的具体方法为： (1) 切取含DNA片段的琼脂糖凝胶IOOmg左右，放入1. 5血离屯、管中，用移液枪头捣碎， 按重量比为1 :3到1 :5的比例加入通用溶胶液； (2) 将离屯、管在手中摇晃5分钟使胶完全溶化，振荡数次W促进琼脂糖凝胶的溶化，所 加通用溶胶液体积大于500 y L ; (3)将离屯、管中的溶液转移到高载量离屯、吸附柱中，套上液体收集管，静置3分钟， 12000-15000g离屯、！分钟并倒掉收集管中的液体； (4)加入500 yL通用洗柱液于离屯、柱中，12000-15000g离屯、1分钟，倒弃收集管中的 废液； (5) 重复第（4)步操作1次； (6) 12000-15000g离屯、1分钟W去除离屯、柱中的残留液体； (7)将离屯、柱置于一新的干净的离屯、管中，加25-50 y L 50-65°C预热的P册.0的TE溶 液，静置3分钟，12000-15000g离屯、1分钟； (8) 离屯、管底部所得溶液即为纯化的DNA溶液，用于后续实验或者放冰箱长期保存。6.如权利要求1所述的纳米细菌16SRNA基因的鉴定方法，其特征在于，步骤五扩增片 段克隆到PMD-18T的具体方法为： (1)在微量离屯、管中配制下列DNA溶液，全量为5y1 ;pMD18-TorpMD19-TVectorIyl Control InsertIyl 地2〇 3 y I 似加入5yI(等量）的SolutionI; (3) 16 °C反应30分钟； (4) 全量（10yI)加入至100yIJM109感受态细胞中冰中放置30分钟； (5) 42°C加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟； (6) 加入890y1SOC培养基，37 °C振荡培养60分钟； (7) 在含有X-Gal、IPTG、Amp的心琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，计数白色、蓝 色菌落； (8) 挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。
【专利摘要】本发明公开了一种纳米细菌16sRNA基因的鉴定方法，该方法包括：根据纳米细菌16sRNA基因序列设计一对引物并进行引物合成；提取纳米细菌全基因组DNA；回收特异性扩增片段；扩增片段克隆到PMD-18T；转化的质粒进行核苷酸测序，将测序结果与纳米细菌16sRNA序列进行比较，鉴定新分离的纳米细菌。本发明发现所获得的特异性片段与基因库中的纳米细菌的16SrRNA基因高度一致，证实了从培养液中提取出的特异性片段即是纳米细菌的16SrRNA，也又一次证实纳米细菌是有生命的微生物。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN105200121
【申请号】CN201510094762
【发明人】郭君毅, 吕宏迪, 张新际, 郝少君, 明爱民, 杨玉荣, 张正臣
【申请人】中国人民解放军第三七一医院
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年3月2日