酸甲酯的合成
[0057] 方案2步骤B :在22°C以滴加方式向搅拌的硅胶（200g，3. 33mol)和二氯甲烷 (IlOOmL)的混合物中加入高碘酸钠（56. 2g，260mmol)在水（352mL)中的溶液。在添加结 束后，将该混合物再搅拌30分钟，然后加入3-苯氧基-1，2-丙二醇（34. 5g, 195mmol)，导 致适度放热。将该混合物再搅拌30分钟，然后过滤以除去固体，弃去水层，用MgSO4干燥 有机层，过滤以除去固体，用4-[(1幻-1-[[(31?)-1，2,3,4-四氢异喹啉-3-羰基]氨基] 乙基]苯甲酸甲酯（44g，130mmol)处理滤液。然后分小部分加入三乙酰氧基硼氢化钠 (57. 4g，260mmol)。在添加完成时，将该混合物再搅拌1小时，然后加入水（200mL)。加入 32%氨水溶液，直到水层的pH达到10。分离各层，用MgSO4干燥有机层，过滤以除去固体， 减压浓缩滤液。将得到的粗油状物溶于TBME (300mL)，然后加入水（250mL)和IM盐酸水溶 液（200mL)。将得到的淤浆搅拌30分钟，减压浓缩以除去TBME，通过过滤分离得到的白色 沉淀。将该沉淀倾入搅拌的水（400mL)和TBME(400mL)的混合物中，加入32%氨水溶液，直 到水层的pH达到10。除去水层，用饱和氯化钠水溶液（200mL)洗涤有机层。分离有机层， 用MgSO4干燥，过滤以除去固体，减压浓缩。使得到的粗物质进行使用30% - 70% EtOAc/ 己烷梯度的硅胶快速色谱。合并包含产物的级分，减压浓缩，得到标题化合物，为白色固体 (44g，74%收率）。质谱（m/z) :459([M+H]+)。
[0058] 制备 4
[0059] 4-[(lS)-1-[[(3R)-l，2,3,4-四氢异喹啉-3-羰基]氨基]乙基]苯甲酸甲酯盐 酸盐的合成
[0061] 方案2步骤A:将（3R)-3-「「（lS)-1-(4-甲氣基羰基苯基）乙基]氨基甲酰 基]-3, 4-二氢-IH-异喹啉-2-甲酸叔丁酯（5. 5g，12. 5mmol)溶于4M氯化氢的1，4-二噁 烷溶液（30mL，120_〇1)。将该混合物在室温搅拌过夜，然后减压浓缩该混合物，得到标题化 合物，为白色固体（4.70g，100% 收率）。质谱（m/z) :339([M+H]+)，677([2M+H]+)，699([2M+ Na]+)。
[0062] 制备 5
[0063] 4- [ (IS) -I- [[ (3R) -2- (2- (4-氟苯氧基）乙基）-3, 4-二氢-IH-异喹啉-3-羰基] 氨基]乙基]苯甲酸甲酯的合成
[0065] 方塞向 4-[(IS)-I-[[(3R) _1，2, 3, 4-四氢异喹啉-3-羰基]氨基]乙 基]苯甲酸甲酯盐酸盐（800mg, 2. 13mmol)和2-(4-氟苯氧基）乙醛（493mg, 3. 2mmol)在 1，2-二氯乙烷（10.7mL)中的混合物中加入三乙酰氧基硼氢化钠（633mg，2.99mm〇l)，将该 混合物在室温搅拌过夜。加入饱和NaHCO3水溶液（25mL)，用乙酸乙酯（2 X 25mL)萃取水层。 用饱和NaCl水溶液洗涤合并的有机层（25mL)，用MgSO4干燥有机相，过滤，减压浓缩。使得 到的粗物质进行使用〇% - 60% EtOAc/己烷梯度的硅胶色谱。合并包含产物的级分，然后 减压浓缩，得到标题化合物，为无色泡沫（550mg，54%收率）。质谱（m/z) :477([M+H]+)。
[0066] 实施例1
[0067] 4- [ (IS) [ [ (3R) (2-苯氧基乙基）-3, 4- 一氛 _1H-异卩奎琳幾基]氣基] 乙基]苯甲酸的合成
[0069] 万案 3 步骤 A :将 4-[(lS)-l-[[ (3R) (2-苯氧基乙基）-3, 4- 一氛 _1H-异陸 啉-3-羰基]氨基]乙基]苯甲酸甲酯（41. 5g，90. 5mmol)、THF(291mL)和2M氢氧化钠水 溶液（181mL，360mm〇l)的混合物在40°C搅拌过夜。减压浓缩以除去THF。加入水（200mL)， 然后用TBME (2 X 200mL)洗涤水层。将水层冷却至5°C，在搅拌下加入浓盐酸水溶液，直到pH 达到2 (正如通过pH试纸分析评估）。在搅拌下，将该混合物在30分钟内温热至室温，然后 过滤分离固体。将该固体加入到水（500mL)中，加热至80°C达1小时。将该混合物冷却至 室温，过滤分离固体，在45°C真空烘箱干燥固体过夜。将该固体加入到乙酸异丙酯（300mL) 中，剧烈搅拌5h。过滤分离固体，减压干燥固体，得到标题化合物，为白色固体（26g，60%收 率）。质谱（m/z) :445([M+H]+)。
[0070] 实施例2
[0071 ] 4- [ (IS) -I- [[ (3R) -2- (2- (4-氟苯氧基）乙基）-3, 4-二氢-IH-异喹啉-3-羰基] 氨基]乙基]苯甲酸盐酸盐的合成 [0072]
[0073] 万案 3 步骤 A :将 4_ [ (IS) -1- [[ (3R) _2_ (2_ (4_ 氣苯氧基）乙基）_3, 4_ 二 氢-IH-异喹啉-3-羰基]氨基]乙基]苯甲酸甲酯（550mg, I. 15mmol)溶于甲醇（IOmL) 和四氢呋喃（IOmL)的混合物，加入5N氢氧化钠水溶液（0.462mL，2.31mmol)，然后在室 温搅拌过夜。减压浓缩该混合物，得到白色固体。加入4M氯化氢的1，4-二噁烷溶液 (10mL，40mmol)，将该混合物在室温搅拌lOmin。过滤除去混悬的固体，用THF(5mL)冲洗该 固体。减压浓缩合并的滤液，得到白色固体。将该物质在热乙醚（IOmL)中研磨，过滤，得到 标题化合物，为白色固体（535mg，93%收率）。质谱（m/z) :463([M+H]+)，485([M+Na]+)。
[0074] 体外与人EP1、EP2、EP3和EP4的结合
[0075] 由稳定表达人 EPl (Genbank 登记号 AY275470)或 EP4 (Genbank 登记号 AY429109) 受体的重组HEK293细胞制备hEPl和hEP4膜。由用EP2(Genbank登记号AY275471)或 EP3 (同种型VI :Genbank登记号AY429108)受体质粒瞬时转染的HEK293细胞制备hEP2和 hEP3膜。使用Teflon/玻璃匀化器在匀化缓冲液中匀化冷冻的细胞沉淀。等分膜蛋白，用 干冰速冻，然后储存在-80°C。匀化缓冲液（参见例如Mauback，K.A.，British Journal of Pharmacology. 156:316-327(2009))包含 IOmM Tris-HCl，pH 7. 4、250mM 蔗糖、ImM EDTA、0.3mM 吲噪美辛+Complete?和 EDTA，得自 Roche Molecular Biochemicals(目录号 1697498)〇
[0076] 通过饱和结合研究或同源性竞争测定[3H] -PGE^合每种受体的K ,值。在96-孔 格中使用3-倍稀释系列测试化合物，以生成10-点曲线。将稀释的化合物与20 μ g/孔EP1、 10 μ g/ 孔 ΕΡ2、1 μ g/ 孔 EP3 或 10 - 20 μ g/ 孔 EP4 膜一起在 25°C、在 0· 3 - 0· 5nM[3H]-P GE2(PerkinElmer, 118 - 180Ci/mmol)存在下温育90分钟。结合反应使用0. 5mL聚苯乙稀 96-孔深孔板、在 200 μ L MES 缓冲液（IOmM MES pH 6.0,与 KOHUOmM MgCljP ImM EDTA) 中进行。通过比较在2 μΜ PGE2存在下和不存在下的结合，计算非特异性结合率。通过过 滤（TomTek harvester)收集膜，用冷缓冲液（IOmM MES pH 6.0 与 KOHUOmM MgCl2)洗涤 4次，6〇°C烘箱干燥，使用TopCount?检测器将放射性定量为计数/分钟（CPM)。将特 异性结合百分比计算为没有任何抑制剂存在下的结合的百分比，对2 μΜ PGE2存在下的非 特异性结合校准。使用所示的4-参数非线性逻辑方程（Abase方程205)分析数据：y = (A+((B-A)/(l+((C/x) ~D))))，其中y = %特异性抑制，A =曲线基础值；B =曲线峰值；C = 相对IC5。=基于从峰值至基础值的数据范围导致50%抑制的浓度；D =希尔斜率=曲线的 斜率。来自IC5。值的K1转化率（K1= IC5(/(l+[L]/Kd)，其中[L]是配体浓度）。
[0077] 表1 :实施例1和2与人EP1、EP2、EP3和EP4的体外结合
[0078]
[0079] 按照基本上如上所述的方法测试化合物。表1中的数据表明：实施例1和实施例 2的化合物以亚纳摩尔浓度结合hEP4。表1中的数据还表明：实施例1和实施例2的化合 物对hEP4的结合强度超过对hEPl、hEP2和hEP3的结合强度，显示了对于hEP4受体的选择 性。
[0080] 体外人EP4功能件桔抗剂活件
[0081] 在稳定表达人EP4受体的重组HEK293细胞中进行测定。通过在补充了 10%胎牛 血清（FBS)、ImM丙酮酸钠、IOmM HEPES、500 μ g/mL遗传霉素和2mM