L-谷氨酰胺、含有高葡 萄糖和盐酸吡多辛（Invitrogen)的DMEM中培养来维持细胞系。使汇合的培养物生长在 37°C、包含5% 0)2的气氛中。使用0. 25%胰蛋白酶-EDTA采集细胞，以10 7细胞/mL混悬 于冷冻培养基（含有6% DMSO的FBS)，将等分部分储存在液氮中。恰在测定前，用DMEM融 化细胞，离心，重新混悬于cAMP缓冲液。
[0082] 使用HTRF (Cisbio目录#62AM4PEB)测定EP4拮抗剂对PGE2-刺激的cAMP产生的 抑制。将与4000细胞相当的等分部分与50 μ L cAMP测定缓冲液和EP4拮抗剂在室温一 起温育20分钟，所述cAMP测定缓冲液包含预定产生EC8。浓度的PGE 2 (0. 188nM PGE2，来自 Sigma,目录 #P5640-10mg)〇 CAMP 测定缓冲液包含 500mL HBSS、0.1%BSA、20mM HEPES 和 200 μ M IBMX (Sigma 15879)。将 CJ-042794 用作阳性对照（参见 WO 2005/021508,实施例 68,4-{(lS)-1-[({5-氯-2-[(4-氟苯基）氧基]苯基}羰基）氨基]乙基}苯甲酸；还参 见 Murase, A.等人，Life Sciences,拉:226-232 (2008))。为了测定 cAMP 水平，将 cAMP-d2 缀合物和抗cAMP-穴状化合物缀合物在裂解缓冲液中与处理的细胞一起在室温温育1小 时。使用EnVision?板读出器（Perkin-Elmer)检测HTRF信号，以计算在665nm的荧光 与在620nm的荧光之比。使用对于每次实验生成的cAMP标准曲线将原始数据转化成cAMP 量（pmol/孔）。使用如所示的4-参数非线性逻辑方程（Abase方程205)分析数据：y = (A+((B-A)/(l+((C/x) ~D))))，其中y = %特异性抑制，A =曲线基础值；B =曲线峰值；C = 相对IC5。=基于从峰值至基础值的数据范围导致50%抑制的浓度；D =希尔斜率=曲线的 斜率。
[0083] 按照基本上如上所述的方法测试化合物。实施例1的化合物具有对人EP4 测定的〇. 752 ±0. 538ηΜ (η = 12)的IC5。，而实施例2的化合物具有对人EP4测定的 0. 450±0. 256ηΜ(η = 4)的IC5。。该结果表明：实施例1和实施例2的化合物在体外均为人 ΕΡ4的拮抗剂。
[0084] 体外大鼠 ΕΡ4功能件桔抗剂活件
[0085] 将大鼠 EP4cDNA (Genebank 登记 #ΝΜ_03276)克隆入 pcDNA3. 1 载体，随后在 ΗΕΚ293 细胞中转染用于受体表达。将大鼠 ΕΡ4稳定克隆按照比例放大，然后作为细胞库冷冻，用于 未来的化合物筛选。为了在rEP4细胞中测试ΕΡ4拮抗剂化合物，融化冷冻的细胞，然后将细 胞重新混悬于cAMP测定缓冲液。该cAMP缓冲液由补充了 20mM HEPES (Hyclone，SH30237)、 0.1 % BSA (Gibco, 15260)和 125 μ M IBMX (Sigma, 15879)的无酚红的 HBSS 构成 (Hyclone，SH3〇268)(参见例如 Murase, A.等人，Life Sciences,拉:226_232(2〇〇8))。将 细胞在平底96-孔聚苯乙烯黑色板（Costar3694)的一半区域内铺板。用DMSO顺序稀释化 合物，得到10-点浓度响应曲线。然后将稀释的化合物以1/100的DMSO/缓冲液之比加入 至Ij包含PGE2 (Cayman 14010,以预定产生EC8。的浓度）的cAMP测定缓冲液中。在室温用所 述化合物在PGE2 (EC8。浓度）存在下处理细胞30分钟。用cAMP HTRF测定试剂盒（Cisbio 62AM4PEC)对从细胞生成的cAMP水平定量。用EnVision板读出器、使用HTRF优化方案 (PerkinElmer)读取板。使用Graphpad Prism(v. 4)非线性回归、S形剂量响应曲线拟合计 算 IC50。
[0086] 按照基本上如上所述的方法测试化合物。实施例1的化合物具有对大鼠 EP4测定 的2. 0nM(n = 1)的IC5。，而实施例2的化合物具有对大鼠 EP4测定的6. 7nM(n = 1)的IC5。。 该结果表明实施例1和实施例2的化合物在体外均为大鼠 EP4的拮抗剂。
[0087] 在人全血中的体外桔抗剂活件
[0088] 认为PGE^ LPS-诱导的TNF α从巨噬细胞/单核细胞产生的抑制作用由EP4受 体介导（参见Murase, Α.等人，Life Sciences,迎:226-232 (2008))。实施例1的化合物 逆转PGEJi LPS-诱导的人全血中TNF α产生的抑制作用的能力是功能活性的标记。
[0089] 从正常志愿者供体中将血液采集入肝素钠真空采血管。供体在献血前的48小时 内未服用NSAIDs或塞来昔布或在献血前的2周内未服用糖皮质激素。将全部试管/供体收 集入50mL Falcon尖底离心管，以98 μ L/孔分配入96-孔组织培养板（Falcon 3072)。将化 合物稀释入DMSO至最终100X，将1 μ L/孔以一式三份加入到血液中，得到7-点浓度响应曲 线。用化合物在37°C、5% 0)2加湿气氛中预处理血液30分钟，此后，将1 μ L/孔的lmg/mL 的脂多糖（LPS) (Sigma 0111 :B4)在0. 2mg/mL牛血清白蛋白（BSA)/PBS中的溶液与和不与 ImM PGE2 (Cayman 14010) -起加入至得到最终LPS浓度为10 μ g/mL，其中含有和不含IOnM PGE2。将板在37°C、在5 % 0)2加湿气氛中温育20-24小时。将板在22°C、在Eppendorf 58IOR 离心机中以1800Xg离心10分钟。从细胞层中取出血浆，转入V型底聚丙烯板。通过商购 酶免疫测定法（R&D Systems DY210)、使用 Immulon 4HBX 板（Thermo 3855)和 3, 3'，5, 5' 四甲基联苯-4, 4' -二胺底物（KPL 50-76-03)对2 μ L血浆中的TNF α水平进行定量。在 A450-A65。用板读出器（Molecular Devices Versamax)、使用 SOFTmaxPRO(V. 4. 3. 1)软件读取 板。使用Graphpad Prism(v. 4)非线性回归、S形剂量响应曲线拟合计算IC5。。将结果表示 为几何平均值土标准偏差；η =独立测定的次数。
[0090] 按照基本上如上所述的方法测试化合物。实施例1的化合物具有对人ΕΡ4测定的 39±21ηΜ(η = 8)的IC5。，而实施例2的化合物具有对人ΕΡ4测定的61±55ηΜ(η = 5)的 IC5。。该结果表明实施例1和实施例2的化合物在人血液TNFa诱导测定中均为ΕΡ4拮抗 剂。
【主权项】
1. 下式的化合物或其药学上可接受的盐：其中R是H或F。2. 权利要求1的化合物或盐，其为：々3. 权利要求1或权利要求2的化合物或盐，其为：4. 权利要求3的化合物，其为4-[ (IS) -1-[ [ (3R) -2-(2-苯氧基乙基）-3, 4-二 氨-IH-异哇嘟-3-幾基]氨基]乙基]苯甲酸：或其药学上可接受的盐。5. 权利要求4的化合物，其为4-[(lS)-l-[[(3R)-2-(2-苯氧基乙基）-3,4-二 氨-IH-异哇嘟-3-幾基]氨基]乙基]苯甲酸：6. 权利要求3的化合物，其为4- [ (IS) -I- [[ (3R) -2- (2- (4-氣苯氧基）乙基）-3, 4-二 氨-IH-异哇嘟-3-幾基]氨基]乙基]苯甲酸：或其药学上可接受的盐。7. 治疗患者的骨关节炎的方法，包含对有运种治疗需求的患者施用有效量的权利要求 1的化合物或其药学上可接受的盐。8. 治疗患者的类风湿性关节炎的方法，包含对有运种治疗需求的患者施用有效量的权 利要求1的化合物或其药学上可接受的盐。9. 治疗患者的与骨关节炎或类风湿性关节炎相关的疼痛的方法，包含对有运种治疗需 求的患者施用有效量的权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐。10. 权利要求1 - 6的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗。11. 权利要求1 - 6的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗骨关节炎。12. 权利要求1 - 6的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗类风湿性关节炎。13. 权利要求1 - 6的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗与骨关节炎或类风湿性 关节炎相关的疼痛。14. 药物组合物，包含权利要求1 - 6的化合物或其药学上可接受的盐与一种或多种药 学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
【专利摘要】本发明提供式I的化合物或其药学上可接受的盐：其中R是H或F。
【IPC分类】C07D217/26, A61K31/472, A61P29/00
【公开号】CN105209438
【申请号】CN201480028163
【发明人】J·S·约克
【申请人】伊莱利利公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年5月9日
【公告号】CA2908400A1, EP2997015A1, US9371289, US20160052889, WO2014186218A1