一株桑树拮抗性内生菌特基拉芽孢杆菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株桑树拮抗性内生菌特基拉 iSl{Bacillustequilensis)〇
【背景技术】
[0002] 桑椹菌核病（Sclerotediseaseofmulberryfruit)俗称白果病，染病桑椹常 呈灰白色，有臭味，因而失去商品与食用价值。该病来势凶发病快，严重制约果桑产业的 健康发展，在江苏、浙江、上海、重庆、四川等地均有发生，发病率高达30%~90%，严重时甚 至可导致上千亩桑园绝产。根据病原菌及病症的不同，桑椹菌核病分为桑椹缩小性菌核 病、桑椹肥大性菌核病及桑椹小粒性菌核病。其中桑椹缩小性菌核病病原菌桑椹核地仗菌 sAiraiafts)是子囊菌亚门（Ascomycotina)、盘菌纲（Discomycetes)、錯钉 菌目（Helotiales)真菌。
[0003] 目前桑椹菌核病主要依靠物理及化学方法进行防治。物理防治方法包括清除病 果、桑园深耕以及覆盖地膜等。因人工投入大、成本高，且防效有限，物理防治方法无法在生 产中有效运用。菌核病的化学防治是在桑果初花期，利用甲基托布津或多菌灵等化学农药 进行喷雾预防。然而化学农药的使用不仅会带来环境污染、农药残留等负面影响，更会使桑 椹的食品安全性难以保障。所以开发安全、高效、环境友好的菌核病生物防治方法对果桑产 业的健康、可持续发展具有重要意义。
[0004] 植物内生菌（Endophyte)普遍存在于高等植物体内，在与宿主互作过程中，部分 内生菌能通过产生抗菌物质、诱导抗性及促进植物生长等机制增强宿主植物的抗病性。植 物内生菌已成为筛选植物病害生防制剂的重要资源库。近年来利用桑树内生菌进行植物 病害生物防治已多有报道，桑树内生细菌洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderiacepacia) LU10-1菌株能长期定殖于桑树体内，且可作为桑树生长促进剂和桑炭疽病菌的拮抗菌而用 于生物防治；从野生型桑树内生细菌中筛选获得枯草芽孢杆菌ME0717菌株对桑炭疽病菌、 桑漆斑病菌具有抑制作用；从健康桑树中分离获得成团泛菌Swg2对丁香假单胞菌桑致病 变种具显著抑制作用。基于以上研究，筛选对桑椹核地杖菌具有拮抗作用的桑树内生菌，将 为桑椹菌核病的防治提供新的思路和资源。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株对桑椹核地杖菌有很强抑制作用的桑树内生菌。根 据形态学特征、生理生化试验和分子生物学手段将其鉴定为特基拉芽孢杆菌 。通过试验测定确定了其生长温度、发酵产抑菌活性物质的时间，研究发现其 不但对桑树组培苗无致死作用且具有促生作用。
[0006] 桑树内生菌的分离纯化：从重庆市蚕业科学技术研究院采集桑树茎，经严格表面 消毒，利用马铃薯琼脂培养基（PDA)、高氏培养基（GA)、水琼脂培养基（WA)分离桑树内生 菌，采用平板划线法对内生细菌进行分离纯化。
[0007] 内生拮抗菌的筛选：将筛选得到的菌株进行发酵，离心获取发酵上清液，采用抑菌 圈法筛选对桑椹核地杖菌具有拮抗作用的菌株。
[0008] 本发明所述的特基拉芽孢杆菌菌株（7PJ-16)已于2015年5月19日保藏于中国 典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学，邮编=430072,电话：027-68754052)，保 藏编号：CCTCC NO :M 2015319。
[0009] 菌株的形态特征（图1)鉴定：在PDA培养基上37 °C培养12h菌落呈乳白色、圆 形，边缘整齐且光滑，中央突起，有光泽，不透明（图1A)。革兰氏染色呈阳性，细胞呈杆状， 多个菌体细胞相连形成链状（图IB)。37°C培养24h，经芽孢染色观察，其菌体中央有单个 椭圆形芽孢（图1C)。
[0010] 菌株生理生化检测结果表明：内生拮抗细菌7PJ-16菌株兼性厌氧；过氧化氢酶呈 现阳性；能够利用甘露糖、水解淀粉、液化明胶；能够在含7%NaCl的培养基中生长（表1)。 根据7PJ-16的形态学和生化特征，判断其为芽孢杆菌属菌株。
[0011] 表1 :7PJ-16菌株的生理生化试验结果
注：+:阳性；表示阴性 5. 7PJ-16菌株分子生物学鉴定：提取菌株的基因组DNA，采用细菌通用引物：27F: 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，/1492R:5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，进行 16SrDNA 序列的PCR扩增，获得长度为1468bp，获得Genbank登录号为KR708875。将所得序列登陆 到www.ncbi.nlm.nih.gov网站，进行BLAST比对，根据在NCBI上进行Blast序列比对结 果选取相关序列构建系统发育树，系统发育分析结果表明7PJ-16菌株与特基拉芽孢杆菌 CfeciWiA? (KF150708)处于同一最小分枝，且与多株特基拉芽孢杆菌16S rDNA的同源性达到98%以上。根据7PJ-16菌株的菌体形态、培养特征及生理生化特征测定 结果，并结合基于16SrDNA的系统发育分析，将该拮抗菌鉴定为特基拉芽孢杆菌，命名为 B.tequilensis7PJ-16〇
[0012] 6.7PJ-16菌株的培养温度：该菌株在PDB培养基摇床培养，生长范围为 25°C ~45°C，其最适生长温度为25°C，在此条件下有最短的代时68. 6 min和最高的生物量 〇D_可达到6.11。
[0013] 菌株发酵时间对产抑菌活性物质的影响：菌株在PDB培养基发酵48h的无菌发 酵滤液对核地杖菌的抑菌率为38. 5%(图2D)，发酵72h~120h时其抑菌率可达100% (图 2E-G)，当发酵时间延长至144h时其发酵滤液的活性降低，抑菌率仅为32. 8% (图2H)。
[0014] 菌株无菌发酵滤液的热稳定性：取菌株7PJ-16无菌发酵液分别于40°C、60°C、 80°C、100°C处理30min其抑菌活性与未处理对照相比无明显差异（图3)。
[0015] 菌株对桑树组培苗的促生作用：菌株7PJ-16菌体和在PDB培养基发酵96h的无 菌发酵滤液分别与桑树组培苗共培养，菌体及发酵液对桑树组培苗无致死作用，且加入发 酵液的组培苗在培养两周时植株平均增高0. 63cm，与对照组相比增高133. 3% (图4)。
[0016] 本发明的优点是：从桑树中分离获得的特基拉芽孢杆菌UaciWM iewi心，对桑椹缩小性菌核病病原菌桑椹核地杖菌有很强的拮抗作用；该菌株在 25°C~45°C范围内均可生长，且无菌发酵滤液有较强的热稳定性，能够适应田间的温度；其 发酵滤液对桑树组培苗无致死作用且有促生作用；经鉴定与枯草芽孢杆菌具有很近的遗传 距离，并且该菌种未有对人畜致病性报道，因此具有潜在的商业开发和应用价值，在桑椹菌 核病的生物防治实践中具有重要的应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1为7PJ-16菌株的形态特征：A.菌株7PJ-16在PDA培养基上菌落形态；B.革 兰氏染色；C.芽孢染色 图2为7PJ-16菌株发酵时间对产抑菌活性物质的影响：CK.灭菌水+PDA;A-H.PDA+ 菌株7PJ-16 28°C发酵6h、12h、48h- 144h的无菌发酵滤液 图3为7PJ-16菌株无菌发酵滤液的热稳定性：A :灭菌水+PDA ;B :未处理发酵活性滤液+PDA ;C-F PDA+经40°C，60°C，80°