抗tnf-抗il-17双特异性抗体的制作方法
【专利说明】抗TNF-抗IL-17双特异性抗体
[0001] 本发明处于医学领域，特别是针对肿瘤坏死因子a(TNFa)和白细胞介素-17 (IL-17A)的双特异性抗体新领域。本发明的双特异性抗体预期可用于治疗类风湿性关节炎 (RA)、牛皮癣关节炎（PsA)和强直性脊柱炎（AS)。
[0002] RA是全身性、慢性、炎性疾病。炎症主要由许多细胞因子包括TNFa和IL-17驱动。 目前FDA批准的生物制品(例如与TNFa结合且中和TNFa的HUMIRA?已证实在患者子集中 降低RA的体征与症状以及减慢RA进展中的功效。IL-17抗体也在用于多种自身免疫疾病 (例如类风湿性关节炎)的临床试验中进行研究（secukinumab、ixekizumab和brodalumab)。 然而，因为炎症由许多细胞因子驱动，所以在单一抗体中靶向两种细胞因子将是有利的。因 此同时靶向TNFa和IL-17两者将是有利的，以减轻RA患者中的炎症且使免疫应答降到最 低。
[0003]目前，TNFa抗体和IL-17抗体的共施用需要两种分开产品的注射或两种不同抗 体的共同制剂的单一注射。两次注射允许剂量量和时机的灵活性，但出于顺应和疼痛两者 对于患者是不方便的。共同制剂还可以提供剂量量的一些灵活性，但由于两种不同抗体的 不同分子特征，发现允许两种抗体的化学和物理稳定性的配制条件是相当挑战性或不可能 的。此外，共施用或共同制剂涉及两种不同药物疗法的累积成本，这可以增加患者和/或支 付者成本，而单一双特异性抗体允许价格对于递送的利益最佳化。
[0004]W02010/102251公开了结合TNF a和IL-17的双重可变结构域免疫球蛋白 ("DVD-Ig")。DVD-Ig是多特异性免疫球蛋白，其具有含相同特异性和相同CDR序列的两条 相同的抗原结合臂，并且对于它与之结合的每种抗原是二价的。每个抗原结合臂具有串联 连接的两条不同的可变结构域，而在可变结构域之间不含插入恒定区，并且每个可变结构 域对于不同抗原具有特异性。W01995/09917公开了通过产生与具有不同特异性的完整抗 体融合的单链抗体，使用重组DNA技术用于产生双特异性、四价抗体的方法。这种基因融 合物通过转染进行表达，导致具有双重特异性的四价抗体。美国专利号6, 090, 382公开了 与hTNFa结合且中和hTNFa的人抗体。W02007/070750公开了结合且中和人IL-17的抗 IL-17抗体。
[0005] 尽管上文公开内容，但当构建本发明的双特异性抗体时，遇到与化学和物理稳定 性相关的显著问题。在起始双特异性抗体以充分克服无数问题中需要许多变化，包括稳定 单链片段可变区的VH/VL界面，增加热稳定性，减少聚集，且重新平衡双特异性抗体的结合 表面中的静电分布，全部同时维持对于两种抗原的结合亲和力。
[0006] 因此，仍存在中和人TNFa和人IL-17两者的单一双特异性抗体的需要。期望提供 双特异性抗体，其是热稳定的，物理稳定的，显示出低聚集，且中和人TNFa和人IL-17。还 期望提供包括单一双特异性抗体的药物组合物，所述单一双特异性抗体中和人TNF a和人 IL-17两者，从而避免发现配制条件的挑战，所述配制条件必须满足两种不同的分开抗体的 不同分子特征。本发明因此寻求解决上述问题中的一个或多个。
[0007] 本发明提供了包含第一多肽和第二多肽的双特异性抗体，其中所述第一多肽具有 SEQIDNO: 1的氨基酸序列，并且所述第二多肽具有SEQIDN0: 2的氨基酸序列。
[0008] 本发明提供了包含两条第一多肽和两条第二多肽的双特异性抗体，其中所述第一 多肽具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列，并且所述第二多肽具有SEQIDN0: 2的氨基酸序 列。
[0009] 本发明还提供了包含编码第一多肽的多核苷酸序列的DNA分子。
[0010] 本发明进一步提供了包含编码第二多肽的多核苷酸序列的DNA分子。
[0011] 本发明提供了包含编码第一多肽和第二多肽的多核苷酸序列的DNA分子。
[0012] 本发明还提供了由一种或多种DNA分子转化的哺乳动物细胞，其中所述细胞能够 表达包含第一多肽和第二多肽的双特异性抗体。
[0013] 本发明提供了用于产生包含两条第一多肽和两条第二多肽的双特异性抗体的方 法，该方法包括在条件下培养哺乳动物细胞，从而使得双特异性抗体被表达。
[0014] 本发明进一步提供了通过所述方法产生的双特异性抗体。
[0015] 本发明还提供了治疗类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎或强直性脊柱炎的方法，其 包括给有此需要的患者施用治疗有效量的根据本公开内容的双特异性抗体。
[0016] 本发明提供了用于疗法中的根据本公开内容的双特异性抗体。
[0017] 本发明进一步提供了根据本公开内容的双特异性抗体用于制造药剂的用途，所述 药剂用于治疗类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎或强直性脊柱炎。
[0018] 本发明进一步提供了根据本公开内容的双特异性抗体，用于治疗类风湿性关节 炎、牛皮癣关节炎或强直性脊柱炎。
[0019] 本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的双特异性抗体和一种或多种药学可 接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0020] 如本文使用的，术语"人IL-17"应理解为涵盖包含两条15kD人IL-17A蛋白质的 同二聚蛋白质（也称为"人IL-17A")，以及包含15kD人IL-17A蛋白质和15kD人IL-17F 蛋白质的异二聚蛋白质（也称为"人IL-17A/F")。
[0021] 如本文使用的，术语"双特异性抗体"应理解为包含如本文描述的两条第一多肽和 两条第二多肽。双特异性抗体结合两种不同抗原，对于每种抗原具有特异性。双特异性抗 体能够单独结合每种抗原或同时结合每种抗原。进一步理解该术语涵盖对双特异性抗体的 任何细胞翻译后修饰，包括但不限于糖基化概况。
[0022] 本发明的双特异性抗体包含两条第一多肽和两条第二多肽。第一多肽之一与第二 多肽之一形成链间二硫键。两条第一多肽各自彼此形成两条链间二硫键，并且第一多肽各 自形成至少一个链内二硫键。多肽和二硫键的关系显示于下述简图中，仅用于举例说明性 目的：
[0023] 第一多肽的氨基酸序列是：
[0024] 含有SEQIDN0: 3的DNA序列的表达载体编码具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列 的第一多肽。
[0025] 第二多肽的氨基酸序列是：
[0026] 含有SEQIDN0: 4的DNA序列的表达载体编码具有SEQIDN0: 2的氨基酸序列 的第一多肽。
[0027] 第一多肽之一和第二多肽之一的链间二硫键在SEQIDNO: 1的半胱氨酸残基135 和SEQIDN0: 2的半胱氨酸残基214之间形成。一条第一多肽与另一条第一多肽形成两 个链间二硫键。第一链间二硫键在SEQIDNO: 1的第一多肽的半胱氨酸残基227和SEQ IDNO: 1的另一条多肽的半胱氨酸残基227之间形成。第二链间二硫键在SEQIDNO: 1 的第一多肽的半胱氨酸残基230和SEQIDNO: 1的另一条多肽的半胱氨酸残基230之间 形成。
[0028] 至少一个链内二硫键在第一多肽各自中的SEQIDNO: 1的半胱氨酸残基505和 半胱氨酸残基705之间形成。
[0029] 第一多肽包含第一重链可变区（HCVR1)、重链恒定区（CH)、第二重链可变区 (HCVR2)和第二轻链可变区（LCVR2)。第二多肽包含第一轻链可变区（LCVR1)和轻链恒定区 (CL)。HCVR和LCVR区可以进一步再分成称为互补决定区（CDR)的高变异性区域，由构架区 (FR)间隔。每个HCVR和LCVR区由三个⑶R和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端以下述 次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
[0030]HCVR1 的 3 个CDR在本文中被称为CDRH1-UCDRH1-2 和CDRH1-3。HCVR2 的 3 个CDR 被称为CDRH2-UCDRH2-2 和CDRH2-3。同样地，LCVR1 的 3 个CDR被称为CDRL1-UCDRL1-2 和CDRL1-3,并且LCVR2 的 3 个CDR被称为CDRL2-1、CDRL2-2 和CDRL2-3。
[0031] CH通过氨基酸接头（L1)融合至HCVR2。HCVR2通过氨基酸接头（L2)融合至LCVR2。
[0032] 本发明还涵盖双抗体。双抗体是双特异性抗体，其中HCVR2和LCVR2区在单条多 肽链上表达，但代替可变结构域与相同链的互补结构域配对，可变结构域与另一条链的互 补结构域配对。例如，如果双特异性抗体包含两条第一多肽(为了方便起见，1A和1B)和两 条第二多肽(为了方便起见，2A和2B)。1A多肽的HCVR2与1B多肽的LCVR2的互补结构域 配对，而不是与1A多肽的LCVR2配对，并且反之亦然。如本文描述的双特异性双抗体维持 对于人TNFa和人IL-17两者的结合亲和力和中和能力。
[0033] 可替代地，从上文描述的双特异性抗体中纯化掉双抗体可以是有利的。在细胞表 达后，双抗体含量可以高达17%，并且在纯化后，可以降低至小于1%。
[0034]多个区域和接头的关系如下，从氨基末端到羧基末端排列，根据Kabat编号约定：
[0035] 双特异件抗体改浩 当构建本发明的双特异性抗体时，遇到与化学和物理稳定性相关的显著问题。例如，亲 本IL-17抗体显示出在高浓度下的物理稳定性局限性(例如相分离)。另外，由亲本IL-17 抗体构建的双特异性抗体显示出浓度依赖性自聚集。因此在双特异性抗体的CDRL2-1和 CDRH2-2部分中制备化学修饰，以改善化学和物理稳定性，且降低浓度依赖性聚集。与LC/ MS组合的广泛蛋白质稳定性和可溶性研究鉴定⑶RL2-1和⑶RH2-2中的化学不稳定残基。 使用通过密码子耗尽（codond印letion)构建的靶向文库，将这些易变残基替换为电荷中 性的氨基酸。替换这些易变残基导致改善的化学稳定性。另外，计算双特异性抗体的静电 表面且鉴定荷电贴片。破坏这些荷电贴片导致蛋白质自结合中的减少。因此，在双特异性 抗体的CDRH2-1和CDRL2-1部分中鉴定了突变，其重新平衡表面静电分布，改善热稳定性， 降低聚集，且改善化学稳定性(消除特异性脱酰胺和氧化位点）。上述修饰无一在亲本单一 抗体的初始表征中得到鉴定。这些变化仅在构建双特异性抗体的背景下遇到，提示在单一 抗体的突变区域周围的局部环境在双特异性抗体的背景下不同。
[0036]制备进一步的化学修饰，以降低双特异性抗体聚集。特别地，制备化学修饰以稳定 双特异性抗体的IL-17部分中的VH/VL界面。为测定双特异性抗体聚集背后的驱动力而进 行的研究显示：所观察到的蛋白质自结合不由个别VH或VL结构域的构象不稳定性驱动， 而是由VH-VL界面的开放或"呼吸（breathing)"驱动，导致分子间蛋白质相互作用。因此， 将多个链内二硫键引入双特异性抗体的IL-17部分的VH-VL界面内。一个此类链内二硫键 在第一多肽各自中出现在SEQIDNO: 1的半胱氨酸残基505和SEQIDNO: 1的半胱氨酸 残基705之间。该二硫键共价连接双特异性抗体的IL-17部分中的VH和VL界面，这稳定 VH-VL界面，且降低分子间蛋白质相互作用，其可以导致物理不稳定性和不利的配制局限 性。在测试的九个不同二硫键中，其中8个表达功能蛋白质，亲和力丧失量级范围为约2至 约35倍。在SEQIDNO: 1的半胱氨酸残基505和SEQIDNO: 1的半胱氨酸残基705之 间，在第一多肽各自中的链内二硫键最佳稳定VH/VL界面，同时维持对于IL-17的最佳结合 亲和力。
[0037]另外，研究指示L1的接头长度影响双特异性抗体的功能活