基化的胞嘧啶；3)该酶切位点不含有CpG 二核苷酸位点；与待测DNA片段连接方式为“T-A”连接；引物设计成与经过亚硫酸氢盐翻转转化的辅助接头互补的序列，当进行酶切时，采用针对所设计的甲基化的酶切位点进行切割的酶进行单酶切；
(V)辅助接头设计同f、h接头设计，进一步在辅助接头中靠近辅助接头与待测DNA连接点的上游20-30bp内位置设计酶切位点，该酶切位点同时满足以下四点:1)该酶切位点至少包含一个甲基化胞嘧啶；2)酶切位点内不含有非甲基化的胞嘧啶；3)该酶切位点不含有CpG 二核苷酸位点；4)该酶的切割位点位于辅助接头与待测DNA连接点的上、下游5bp内；
在引物设计成与经过亚硫酸氢盐翻转转化的辅助接头互补的序列，当进行酶切时，采用针对所设计的甲基化的酶切位点进行切割的酶进行单酶切；
(VI)是(V)和b、d、f、h的组合，通过调整辅助接头的长度使两个酶切位点重合，该方案可以使用双酶切去除辅助接头；在引物设计成与经过亚硫酸氢盐翻转转化的辅助接头互补的序列，当进行酶切时，采用针对所设计的甲基化的酶切位点进行切割的酶进行双酶切。
[0015]其中在(IV)中，在所述引物5’端设计另外一个酶切位点，通过调整辅助接头的长度使两个酶切位点重合；当进行酶切时，采用针对所设计的限制性内切酶的酶切位点的酶进行双酶切。
[0016]
【具体实施方式】
[0017]以下结合实施例对本发明技术方案做进一步说明，所述的实施例是对本发明的解释而不是限定。
[0018]实施例1:
实施例中接头、qPCR检测引物与磺酸化处理后DNA的PCR扩增引物为人工合成序列由Invitrogen公司合成；所使用的C0T1DNA购买于Invitrogen公司。
[0019]1.片段化获得的基因组DNA，末端修复并添加A碱基
2.辅助接头1的连接
从试剂盒中取出2XRapid连接缓冲液和AluLinker，将其置于冰上融解并充分混匀2 X Rapid连接缓冲液。在2.5mL的离心管中配制100 μ L的连接反应体系:30 μ L加Α碱基回收产物、40 μ L2xRapid 连接缓冲液、8 μ L (辅助接头)(50uM) (5’-AGCTGGGCACCGCTCATGCCACTCCGGCT，5’-pGCCGGAGTGGCATGAGCGGTGCCCAG)、12 μ LT4DNA 连接酶与 5 μ L 超纯水。温浴15分钟后用ZYM0DNAClean&ConcentratorPTMP-5回收纯化加有辅助接头1的DNA，产物溶于40 μ L的TE中。
[0020]3.MeDIP方法甲基化DNA的免疫共沉淀和去除重复序列，亚硫酸氢盐处理及PCR扩增 4.酶切去除辅助接头1
(1)在1.5mL的离心管中配制100 μ L反应体系:PCR扩增产物(?350ng，不超过 500ng)，15μ L10X 缓冲液 3 (ΝΕΒ)，1 μ L100XBSA，3 μ Lsinefungine (10mM)，30μ L10XATP,3y LEcoP15I (20υ/μ L)，补水至 120μ L ；
⑵36°C酶切过夜，第二天补1 μ L酶继续酶切2小时。纯化，结合缓冲液用量为5倍，50 μ L洗脱；
(3)吸取50 μ LofStreptavidin-M-280 (Invitrogen)到 1.5mL 不粘管，用 1 XB&ff 缓冲液洗磁珠两次；
(4)将磁珠重悬于60μ L2 X B&ff缓冲液，加60 μ L酶切产物(step2 )；
(5)常温旋转30分钟；
(6)将磁珠上清移至新的1.5mLEppendorf管中，用Qiagen (Mini)纯化，取1 μ L纯化产物于NanoDroplOOO上测得0D值并记录样品浓度。
[0021] 5.测序
将步骤4中去除辅助接头1后的DNA片段直接进行高通量测序。
【主权项】
2.当进行酶切时，采用针对所设计的限制性内切酶的酶切位点的酶进行单酶切； (IV)当辅助接头为f和h时，在辅助接头中靠近辅助接头与待测DNA连接点的上游5bp内位置设计酶切位点，该酶切位点需符合以下三个特点:1)该酶切位点至少包含一个甲基化胞嘧啶；2)酶切位点内不含有非甲基化的胞嘧啶；3)该酶切位点不含有CpG 二核苷酸位点；与待测DNA片段连接方式为“T-A”连接；引物设计成与经过亚硫酸氢盐翻转转化的辅助接头互补的序列，当进行酶切时，采用针对所设计的甲基化的酶切位点进行切割的酶进行单酶切； (V)辅助接头设计同f、h接头设计，进一步在辅助接头中靠近辅助接头与待测DNA连接点的上游20-30bp内位置设计酶切位点，该酶切位点同时满足以下四点:1)该酶切位点至少包含一个甲基化胞嘧啶；2)酶切位点内不含有非甲基化的胞嘧啶；3)该酶切位点不含有CpG 二核苷酸位点；4)该酶的切割位点位于辅助接头与待测DNA连接点的上、下游5bp内； 在引物设计成与经过亚硫酸氢盐翻转转化的辅助接头互补的序列，当进行酶切时，采用针对所设计的甲基化的酶切位点进行切割的酶进行单酶切； (VI)是(V)和b、d、f、h的组合，通过调整辅助接头的长度使两个酶切位点重合，该方案可以使用双酶切去除辅助接头；在引物设计成与经过亚硫酸氢盐翻转转化的辅助接头互补的序列，当进行酶切时，采用针对所设计的甲基化的酶切位点进行切割的酶进行双酶切。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中在(IV)中，在所述引物5’端设计另外一个酶切位点，通过调整辅助接头的长度使两个酶切位点重合；当进行酶切时，采用针对所设计的限制性内切酶的酶切位点的酶进行双酶切。
【专利摘要】本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及的一种甲基化DNA高通量测序接头和引物设计方法。其特征在于针对切位点是否含酶，不同非连接端突出结构类型以及不同连接端类型，设计不同的接头和引物，解决MeDIP与亚硫酸盐翻转导致序列改变之间的矛盾，能够在不影响MeDIP的情况下，经亚硫酸盐之后成功扩增DNA片段库并能进行后续的常规建库。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105316315
【申请号】CN201410376283
【发明人】严冰冰, 孔祥生, 邹晓文, 吴海芳
【申请人】晶能生物技术（上海）有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年8月3日