rinobac termanganoxydans Μη 17-9 (数据库代码 ZP_09158756)、柄杆菌(Cai/JoAacter 6./λ ) K31 (数据库代码YP_001672217)、食油假单胞菌oleovorans)(数据库代码Q00595)的AlkL及其变体。
[0028]另外，如果可用具有烷烃羟化酶的全细胞催化剂的未改变野生型菌株施行本发明，优选的是，根据本发明使用的酶是在全细胞催化剂中重组表达的酶。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“重组的”被理解为是指，编码核酸分子在自然界中不存在，和/或它使用基因工程方法产生。在一个优选的实施方案中，如果对应的多肽由重组核酸编码，则使用术语重组蛋白。在一个优选的实施方案中，本文中使用的重组细胞被理解为是指具有至少一种重组核酸或一种重组多肽的细胞。适合用于生产重组分子或细胞的方法是本领域技术人员已知的，例如在 Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989): Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 版中描述的那些。
[0029]分子氧(02)必须在步骤b)中作为烷烃羟化酶的底物存在。这优选地如下实现:使大气空气接近在其中进行步骤b)的水溶液。优选地在通气下搅拌该水溶液。
[0030]作为水溶液，可使用与全细胞催化剂的活性相容的任何基于水的溶液。其优选地是水性介质，特别优选是基本培养基，其维持全细胞催化剂的代谢活性，但是其包含除了反应物以外尽可能少的其它物质，所述物质会使得到纯形式的反应产物变得困难。例如，可以使用M9培养基。
[0031]烷酸可以是在烷基残基上带有可被酯化的羧基的任意有机化合物。特别优选的是式H3C - (CH2)n - C00H的烷酸，其中η是0或更大，优选2-24，特别优选2-16，最优选4，作为示例是 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或 24。在另一个优选的实施方案中，烷酸是式CnH2n iCOOH的羧基化的环烷烃，其中η是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或 24，且优选 5-8。
[0032]关于烷酸和关于在本申请中描述的化学化合物，给出的各个式包括各种化合物的所有盐(质子化的或去质子化的)。例如，丁酸不仅包括质子化形式，而且包括具有所有阳离子的丁酸盐，例如丁酸钠。
[0033]根据本发明的方法的步骤c)包括将氧化的酯氢化，形成烷二醇和烷醇。在现有技术中，例如，在专利申请W097/31882和ΕΡ1042259Β1中，描述了众多合适的氢化方法，例如使用Zn0/Cu0-催化剂、含有Ru或Rh的催化剂，其与无机氢化物诸如LiAlH4—起使用。
[0034]根据本发明的方法的步骤d)包括蒸馏除去烷醇，形成贫化了烷醇的反应混合物。后者包含产物烷二醇，其可以随后通过其它分离-和洗涤步骤与培养基和与全细胞催化剂分呙。
[0035]所述方法的最终步骤包括将在步骤d)中除去的烷醇返回到步骤a)中，S卩，使所述烷醇与其它烷酸反应，且因此保留在所述方法中。
[0036]此外，通过下述附图和非限制性实施例更具体地描述了本发明，从其中可以推知本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。
[0037]图1显示了用大肠杆菌W3110 pBT1对正丁烷的生物转化中的丁酸-和1_ 丁醇浓度的时程，其得自实施例1的操作。
[0038]图2 显示了使用大肠杆菌 W3110 pCOM1 [Ab_Fd/CYP153_2/Fd0R/alkL]对丁酸丁酯的氧化产物的HPLC-MS分析的质量痕迹(Massenspuren)，其中将10 min样品与7 h样品进行了对比，其得自实施例2的操作。
[0039]图3显示了使用大肠杆菌W3110 pBT1对丁酸丁酯的氧化产物的HPLC-MS分析的质量痕迹，其中将10 min样品与7 h样品进行了对比，其得自实施例2。
[0040]实施例1:通过具有得自恶臭假单胞菌GP01的单加氧酶(alkBGT)的大肠杆菌W3110 pBT1氧化正丁烷。
[0041]a)以10 1规模生产生物质
前种子培养物:制备1升LB培养基(5 g/Ι酵母浸出物、10 g/Ι蛋白胨、0.5 g/1 NaCl，溶解在1 1水中，在121°C高压灭菌20分钟)。
[0042]从该溶液，将5 X 25 ml分别装入100 ml具有挡板的摇动烧瓶中，将25μ1无菌过滤的卡那霉素溶液(50 g/Ι)加入每个烧瓶中，且在每种情况下接种200μ1大肠杆菌W3110pBT1的甘油冷冻培养物。包含质粒pBT1的菌株已经详细描述在W013083412的实施例4中。将这些培养物在37°C和200 rpm (振幅2.5 cm)温育18 h。
[0043]种子培养物:制备1升高细胞密度培养基(HCD培养基)，其由1.76 g/1 NH4S04、19.08 g/1 Κ2ΗΡ04、12.5 g/1 ΚΗ2Ρ04、6.66 g/1 酵母浸出物、1.96 g/1 柠檬酸Na3、17 ml 柠檬酸NH4Fe溶液(1%)、5 ml痕量元素溶液US3 (1升痕量元素溶液US 3由溶解在1 1水中的36.5 g HC1 37%、1.91 g MnCl2 x 4Η20、1.87 g ZnS04 x 7H20、0.8 g Na-EDTA x 2H20、0.3g H3B03、0.25 g Na2Mo04 x 2H20、4.7 g CaCl2 x 2H20、17.8 g FeS04 x 7 H20、0.15 g CuCl2x 2H20 组成)、30 ml 补料溶液(葡萄糖 50%w/v、MgS04 x 7 H20 0.5%w/v、NH4C1 2.2%w/v)和1 ml卡那霉素溶液(50 g/1)组成。将948 ml含有順4304至柠檬酸Na 3的溶液高压灭菌，并将剩余成分各自分别无菌过滤，并然后在无菌条件下加入。pH为6.8。
[0044]将5 X 75 ml HCD培养基加入1000 ml具有挡板的摇动烧瓶中，给每个烧瓶接种25 ml前种子培养物，并在37°C和200 rpm (振幅2.5 cm)培养30 h。
[0045]给无菌的10 1发酵罐装入7 1具有以下组成的无菌培养基:1.75 g/1 (NH4)2S04、19 g/1 K2HP04 x 3 Η20、12.5 g/1 ΚΗ2Ρ04、6.6 g/1 酵母浸出物、2.24 g/1 柠檬酸Na3 x 2H20、15 g/1 葡萄糖、0.49 g/1 MgS04 x 7 H20、16.6 ml/1 梓檬酸 NH4Fe 溶液(l%w/v)、15 ml/1痕量元素溶液(如在种子培养物中一样)、1 ml/1卡那霉素溶液(50 mg/1)和2 ml消泡剂Delamex。补料是高压灭菌的补充了 10 g/Ι的MgS04 x 7H20的葡萄糖溶液(50%w/v)，用0.5M H2S04^P 25%NH 40H 校正 pH。
[0046]将得自摇动烧瓶的培养物在无菌条件下合并，并经由转移瓶接种进发酵罐中。将发酵条件设为p02 30%、气流6 nlpm、搅拌器400 - 1200 rpm、温度37°C、pH 7，8 h开始补料，补料速率150 - 250 g/ho 19 h以后，将温度降低至30°C，并用0.4 mM DCPK诱导。23小时以后，发酵罐中的0D600是约100，在无菌条件下取出培养液，并将500 ml在1000 ml离心烧瓶中在8000 rpm离心。抛弃上清液，并将沉淀物等分进Falcon试管中，每个试管含有10 go将沉淀物在_80°C冷冻用于以后使用。
[0047]b)将正丁烷氧化成1- 丁醇和丁酸
将10 g如在a)中所述的冷冻的生物质再悬浮于50 ml 70 mM磷酸铵缓冲液pH 7 (组成:8 g/Ι (ΝΗ4)Η2Ρ04、0.5 g/1 NaCl、0.49 g/1 MgS04 x 7H20、1 ml 痕量元素溶液US3 和 50μ g/1卡那霉素)中。在此用5%NH40H调节pH。
[0048]将含有约3滴高压灭菌的消泡剂(Delamex)的130 ml 70 mM磷酸铵缓冲液pH 7(组成:8 g/1 (ΝΗ4)Η2Ρ04、0.5 g/1 NaCl、0.49 g/1 MgS04 x 7H20、1 ml 痕量元素溶液US3 和50 yg/l卡那霉素。用5%氨溶液将pH调至7.0)装入300 ml发酵罐中。经由具有0.2Mm孔径的金属烧结perlator，用由25%正丁烷和75%合成空气组成的气体混合物以9 lN/h的流速充气(begast)发酵罐。将发酵罐在水浴中加热至30°C，并通过900 rpm的磁力搅拌器进行搅拌。用2.5%氨溶液将pH调至7.0。连续地补入葡萄糖溶液(葡萄糖补料速率为0.9 g/lh)。使排出气体穿过冰冷却的含有150 ml水的洗瓶。
[0049]将10 g如在a)中所述的冷冻的生物质再悬浮于50 ml磷酸铵缓冲液中并融化。给发酵罐接种混悬液。
[0050]生物质浓度具有25的光密度(600 nm)。在不同时间点从发酵罐取出各5 ml样品。将样品在10 000 g和室温下离心10分钟，并将上清液用0.2Mffl注射器式过滤器过滤。
[0051]通过Agilent Technologies 1200系统上的HPLC-RID，进行丁酸和1_丁醇的色谱分析。使用 Am