inex HPX-87H 柱(300 mm x 7.8 mm)。使用 10 mM H2S04作为洗脱液，以 0.6ml/min的流速和40°C的柱温度运行该系统。在超纯水中制备所有要分析的物质的标准品，并在相同条件下测量。通过保留时间的对比进行评价。
[0052]48 h以后，丁酸浓度是约13.5 g/Ι, 1_ 丁醇浓度是0.125 g/Ι (参见图1)。
[0053]实施例lc:用含有得自Alcanivorax的单加氧酶CYP153的大肠杆菌W3110 pBT1氧化正丁烷。
[0054]给3个装有25 ml含卡那霉素的LB培养基(组成:5 g/Ι酵母浸出物、10 g/1蛋白胨、0.5 g/1 NaCl、50 mg/1硫酸卡那霉素)的100 ml挡板烧瓶各自接种ΙΟΟμΙ具有得自 Mcanivorax的单加氧酶 CYP153 的大肠杆菌 W3110 pCOM1 [Ab_Fd/CYP153-2/Fd0R/alkL]的甘油冷冻培养物，并在37°C和200 rpm温育20 h。使用的菌株详细描述于PCT/EP2013/054928的实施例4和实施例1中。
[0055]然后将每25 ml培养液用作在1000 ml挡板烧瓶中的75 ml改良M9培养基(组成:15 g/Ι 葡萄糖、6.8 g/1 Na2P04、3 g/1 ΚΗ2Ρ04、0.5 g/1 NaCl,2 g/1 NH4C1、15 g/1 酵母浸出物、0.49 g/1 MgS04*7H20、50 mg/1硫酸卡那霉素、15 ml/1痕量元素溶液US3。痕量元素溶液的组成:36.5 g/1 37% 盐酸、1.91 g/1 MnCl2*4H20、1.87 g/1 ZnS04*7H20、0.84g/1 Na-EDTA*2H20、0.3 g/1 H3B03、0.25 g/1 Na2Mo04*2H20、4.7 g/1 CaCl2*2H20、17.3 g/1FeS04*7H20、0.15 g/1 CuC12*2H20)的接种物。将烧瓶在 37°C和 200 rpm 温育 2.5 h。然后将温度降至25°C。在25°C 0.5小时以后，用0.4 mM 二环丙基酮诱导培养物。将培养物在25°C和200 rpm温育另外16 h。
[0056]将培养物合并，转移至50 ml falcon试管，并在5500 g在25°C离心10分钟。抛弃上清液，并将得自300 ml培养物的沉淀物再悬浮于50 ml转化缓冲液pH 7 (组成:8 g/1 (ΝΗ4)Η2Ρ04、0.5 g/1 NaCl、0.49 g/1 MgS04*7H20、50 mg/1 硫酸卡那霉素、15 ml/1 痕量元素溶液US3 ;用25%氨溶液将pH调至7.0)中。
[0057]类似于1.1，用大肠杆菌 W3110 pCOM1 [Ab_Fd/CYP153_2/Fd0R/alkL]进行转化、取样和分析。
[0058]将得自Ι-b)和Ι-c)的丁酸和丁醇通过蒸馏从水相分离，并进一步用在实施例1d中。
[0059]实施例1d:丁酸和丁醇的共沸酯化将88 g 丁酸和81.4 g 1-丁醇(得自实施例lb和lc，且在丁醇的情况下，任选地得自实施例3)以及5 g对甲苯磺酸混合并加热至沸腾。使用水分离器借助共沸蒸馏在回流下进行反应，直到已经分离定量转化的计算水量(18 mL)o将形成的酯(129.6 g 丁酸丁酯)通过蒸馏与过量的1-丁醇和催化剂分离，并转移到实施例2中用于借助全细胞催化剂的氧化。
[0060]实施例2:丁酸丁酯的氧化
给每个装有25 ml含卡那霉素的LB培养基(组成:5 g/Ι酵母浸出物、10 g/Ι蛋白胨、0.5 g/1 NaCl、50 mg/1硫酸卡那霉素)的100 ml挡板烧瓶各自接种ΙΟΟμΙ大肠杆菌W3110 pCOM1 [Ab_Fd/CYP153-2/Fd0R/alkL]或大肠杆菌 W3110 pBT1 的甘油冷冻培养物，并在37°C和200 rpm温育20 h。
[0061]然后将完全预培养物各自用作在1000 ml挡板烧瓶中的75 ml改良M9培养基(组成:15 g/Ι 葡萄糖、6.8 g/1 Na2P04、3 g/1 ΚΗ2Ρ04、0.5 g/1 NaCl,2 g/1 NH4C1、15 g/1酵母浸出物、0.49 g/1 MgS04*7H20、50 mg/1硫酸卡那霉素、15 ml/1痕量元素溶液US3。痕量元素溶液的组成:36.5 g/1 37% 盐酸、1.91 g/1 MnCl2*4H20、1.87 g/1 ZnS04*7H20、0.84g/1 Na-EDTA*2H20、0.3 g/1 H3B03、0.25 g/1 Na2Mo04*2H20、4.7 g/1 CaCl2*2H20、17.3 g/1FeS04*7H20、0.15 g/1 CuC12*2H20)的接种物。将烧瓶在 37°C和 200 rpm 温育 2.5 h。然后将温度降至25°C。在0.5小时以后，用0.4 mM 二环丙基酮诱导培养物。将培养物在25°C和200 rpm温育另外16 h。
[0062]将培养物转移至50 ml falcon试管，并在5500 g在25°C离心10分钟。抛弃上清液，并将得自每种菌株的沉淀物再悬浮于50 ml转化缓冲液pH 7 (组成:8 g/1 (ΝΗ4)Η2Ρ04、0.5 g/1 NaCl、0.49 g/1 MgS04*7H20、50 mg/1 硫酸卡那霉素、15 ml/1 痕量元素溶液 US3 ;用25%氨溶液将pH调至7.0)中，并在500 ml挡板烧瓶中在30°C和180 rpm温育。
[0063]为了开始反应，将2 g/Ι 丁酸丁酯和5 g/Ι葡萄糖加入每个烧瓶中。将含有缓冲液、丁酸丁酯和葡萄糖且不含细胞的烧瓶温育作为阴性对照。
[0064]生物质浓度具有2.5的光密度(600 nm)。在10 min和7 h以后分别取2 ml样品。将样品在10 000 g在室温离心10分钟，并用0.2Mffl注射器式过滤器过滤上清液。
[0065]通过HPLC-ES1-MS (Thermo Fisher Scientific)，进行丁酸丁酯的氧化产物的筛选。由于它们的准确质量和由此推导出的经验式，可以鉴别丁酸丁酯和由此衍生出的氧化产物。在两个实验批次中，尤其可以检测出单端和两端羟基化的酯(参见图2和3)。
[0066]实施例3:氧化的丁酸丁酯的还原氢化，形成1，4- 丁二醇:
将740 mg氢化铝锂预先装入50 mL干燥的乙醚中，并将10 g得自实施例2的氧化的酯在0°C缓慢地逐滴加入。在完全加入后，将混合物加热至沸腾，并在回流下搅拌直到完全转化。
[0067]将得到的醇通过蒸馏进行分离。得到7.41 g 1，4-丁二醇和1.77 g 1_ 丁醇。将丁醇再循环至实施例1d并在那里酯化。
【主权项】
1.包括以下步骤的方法: a)使烷酸与烷醇反应，产生酯， b)通过在水溶液中和在分子氧存在下接触表达烷烃羟化酶的全细胞催化剂，氧化所述酯的至少一个末端碳原子，产生氧化的酯， c)氢化该氧化的酯，形成α,ω-烷二醇和烷醇，和 d)蒸馏除去烷醇，形成贫化了烷醇的反应混合物，和 e)将该烷醇返回到步骤a)中。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的烷酸是式H3C - (CH2)n-C00H的烷酸，且其中η > 0，优选2-16。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述烷酸是丁酸。4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的烷酸是式CnH2nfOOH的羧基化的环烷烃，其中η > 4，优选5-8。5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述烷醇是式Cn0H2n+2的烷醇且η>0。6.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中步骤a)中的烷酸和烷醇具有相同的碳骨架。7.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中步骤a)中的全细胞催化剂表达烷烃羟化酶，所述烷烃羟化酶选自:得自恶臭假单胞菌的AlkB及其变体，和得自Alcanivonmsborkumensis SK2 的 CYP153 及其变体。8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中借助酸催化的酯形成进行步骤a)，优选在有机溶剂存在下。9.根据权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中借助与酯酶、蛋白酶或脂肪酶的接触，在水溶液中进行步骤a)，所述酯酶、蛋白酶或脂肪酶优选地以表达酯酶或脂肪酶的全细胞催化剂的形式提供。10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中通过将烷烃氧化成烷酸，提供步骤a)中的烷酸。
【专利摘要】本发明涉及一种用于制备α,ω-烷二醇的方法，所述方法包括下述步骤a)使烷酸与烷醇反应，产生酯，b)通过在水溶液中和在分子氧存在下接触表达烷烃羟化酶的全细胞催化剂，氧化所述酯的至少一个末端碳原子，产生氧化的酯，c)氢化该氧化的酯，形成烷二醇和烷醇，和d)蒸馏除去烷醇，形成贫化了烷醇的反应混合物，将该烷醇返回到步骤a)中。
【IPC分类】C12P7/18, C12P7/52, C12P7/16, C12P7/62, C12P7/02, C12P7/40
【公开号】CN105358700
【申请号】CN201480017847
【发明人】T.哈斯, P.恩格尔, J.C.普费弗, O.图姆, C.格林
【申请人】赢创德固赛有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2014年1月10日
【公告号】EP2759598A1, EP2948555A1, US20150353963, WO2014114505A1