质素筛选培养基平板，37°C恒温培养48h，根据菌落生长情况调整稀释梯度。 保持培养条件不变，48h后挑取各平板上的单菌落在木质素筛选培养基平板上反复划线纯 化。挑取纯化后的单菌落点接于木质素苯胺蓝培养基平板，37°C避光恒温培养48h，测量各 菌株的透明圈直径H与菌落直径C，筛选出H/C值较大的菌株。对获得的菌株进行继代培 养，连续传代10次，观察菌株的生长状况并且测定H/C值。根据菌株各代菌落形态、菌落直 径、透明圈直径和H/C值大小，确定菌株生长状况和对木质素降解效果的稳定性采用-80°C 甘油冷冻法进行保存，分离菌株保存3管，写明标签（菌株编号、分离地点、生境类型和保存 时间）。
[0033] 2、菌株H/C值测定
[0034] 将菌株点接于木质素苯胺蓝培养基平板，37°C避光恒温培养48h，测量各菌株的透 明圈直径H与菌落直径C。
[0035] 3、结果分析：
[0036] 3. 1、菌株筛选
[0037] 通过上述的分离筛选过程，共获得134株可在木质素筛选培养基上生长的菌株。 将这134株菌株纯化后接种于木质素苯胺蓝培养基上进行筛选，根据透明圈产生时间、清 晰度和H/C值大小筛选出木质素降解菌。菌株Sl透明圈产生迅速并且清晰，H/C值较大的 菌株，确定为高效木质素降解菌，根据筛选菌株的样品来源，分别编号。将上述菌株进行10 次传代培养后，菌株菌落生长情况、外观形态以及菌株的H/C值均无明显变化，表明菌株生 长情况、产酶情况以及酶活力稳定，无退化现象。
[0038] 3.2、菌株!1/(：值测定
[0039] 菌株Sl透明圈产生清晰迅速，并且H/C值较大；经10次传代培养后，该菌株的 生长情况、产酶情况以及酶活力稳定，无退化现象，对这株菌的透明圈直径H与菌落直径C 进行测定以及数据分析。菌株Sl的平均菌落直径为0. 40±0. 10cm，最大菌落直径可到达 0. 50cm ;平均降解圈直径为1. 21 ±0. 03cm，最大降解圈直径能达到I. 24cm。菌株Sl的平均 H/C值为3. 00±0. 02,最大H/C值能达到3. 02。
[0040] 表2 Sl菌株降解效果
[0042] 4、基因组DNA的提取
[0043] 将上述筛选得到的菌株Sl基因组DNA采用热破壁法提取。取ImL接种于LB液体 培养基37°C 180r/min振荡培养24h的菌悬液，打入I. 5mL离心管中，5000r/min离心5min， 弃上清，加入ImL ddH20,吸打均勾，使菌体悬浮，5000r/min离心5min，弃上清，加入200 yL ddH20,吸打均勾，使菌体悬浮；于沸水浴中8~lOmin，10000r/min离心10min。吸取上清 液，转移至另一支I. 5mL离心管中，取5 μ L点样，以λ EcoTH为Marker，1 %琼脂糖凝胶电 泳检测，其余_20 °C保存。
[0044] 5、16S rDNA 的 PCR 扩增
[0045] 采用16S rDNA通用引物，以所提取的菌株基因组DNA为模板，按照如下反应体系 和扩增条件进行扩增。引物序列反应体系及扩增条件分别如表3、表4所示。PCR产物用 1 %的琼脂糖电泳检测。
[0046] 表3 16S rDNAPCR扩增的引物序列
[0048] 表4 16S rDNA的PCR扩增的反应体系和反应程序
[0051] 5. IPCR产物的回收纯化
[0052] 将含有目标条带的PCR产物全部点样（80 μ L/孔，共两孔），1. 5%的琼脂糖凝胶电 泳，电泳条带用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，具体步骤如下：
[0053] (1)柱平衡步骤：向吸附柱CA# (放入收集管中）加入500 μ L平衡液BL，12000r/ min，离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0054] (2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净 的离心管中，称取重量。公式：（装胶后的重量-装胶前离心管的重量）XlOOO ="1000倍 体积" yL。
[0055] (3)向胶块中加入" 1000倍体积"溶胶液PN，50°C水浴放置lOmin，其间不断温和 地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解，冷却，将胶溶液温度降至室温再上柱，上柱后停 留2~5min。
[0056] (4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2*，将吸附柱放入收集管中，13000r/ min离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
[0057] (5)向吸附柱中加入600 μ L漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 停留2min，13000r/min离心lmin，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
[0058] (6)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液PW，13000r/min离心30秒，倒掉废液。将离心 吸附柱入收集管中，13000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于50°C烘 箱中烘数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验（影响回收效率和DNA 质量）。
[0059] (7)将吸附柱放到一个干净的离心管中（剪掉帽），向吸附膜中间位置悬空滴加 30 μ L洗脱缓冲液EB，室温放置2min，13000r/min离心Imin收集DNA溶液。
[0060] (8)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中， 13000r/min离心Imin收集DNA溶液，重复3次洗脱。
[0061] (9)将DNA溶液放置于有盖的离心管中（最后一次洗脱时），保存于-20°c，以防 DNA降解。取少量回收后的DNA溶液用1 %的琼脂糖电泳验证其纯度及含量。
[0062] 5. 2目的片段与克隆载体的连接
[0063] 将上一步PCR回收纯化得到的DNA片断与pMD18-T载体混合均匀，4°C反应过夜。 连接体系如下：
[0065] 将连接后的载体转入E. coli DH5a感受态细胞中，摇培后，涂板，挑取白色菌落接 种于含有Amp的LB培养基中37°C、180r/min摇床培养10~12小时。
[0066] 5. 3阳性克隆子检测
[0067] 以所得菌液为模板进行PCR扩增，引物序列（参见pMDIS-T Vector说明书）、反应 体系及扩增条件分别如表5和表6所示，产物用1 %的琼脂糖电泳检测。
[0068] 表5重组子PCR检测所使用的引物序列
[0070] 表6重组子PCR检测的反应体系和反应程序
[0071]
[0072] 5· 416SrDNA 序列分析
[0073] 将得到的阳性克隆送往上海生工（Sangon Biotech)生物工程股份有限公司进 行测序，用BioEdit 7. 09软件分析测序结果，截除引物序列，将获得的序列结果提交到 GenBank数据库获得登录号，通过BLASTn程序（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)进行在线 分析，下载相似性大于90%的模式菌株的序列，并用Clustal X软件进行多重序列比对，然 后采用软件MEGA 5. 03中的Neighbor-Joining构建系统发育树，确定菌株的种属关系。
[0074] 6、菌株16S rDNA序列鉴定结果
[0075] 6. I、1防 rDNA 序列 PCR 扩增
[0076] 16S rDNA序列PCR扩增产物以1 %琼脂糖凝胶电泳检查，结果如图2所示。菌株 Sl的16S rDNA基因片段长度约为1500bp。
[0077] 6. 2、PCR 产物回收
[0078] 对6. 1中的16S rDNA序列PCR扩增产物以1. 5 %琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条带 以DNA胶回收试剂盒回收。PCR产物回收电泳图谱如图3所示，根据条带亮度可知，本实验 已成功回收到足量的纯化PCR产物，可用于后续试验进行。
[0079] 6. 3、阳性克隆子筛选
[0080] 将纯化后的16S rDNA PCR扩增产物与T载体连接，转化至大肠杆菌感受态细胞， 以所得菌体为模板进行PCR扩增，结果如图4所示，已获得具有重组质粒的阳性克隆子。
[0081] 6. 4、16S rDNA核苷酸序列测定
[0082] 各菌株的16S rDNA核苷酸序列测定结果见序列表1，各菌株的系统发育树如图5 所示。结合形态学及生理生化鉴定结果，确定各菌株的种属，结果见表7。
[0083] 表7菌株的种属
[0085] 7、菌株的最佳培养条件
[0086] 以pH、温度、氮源、培养时间、转速五个试验因素，按正交表L18 (35)设计正交试验， 以确定木质素降解菌的最佳培养条件如表8所示。
[0087] 表8正交试验试验因素与水平
[0089] 菌株Sl正交试验结果，见表9。
[0090] 表9菌株Sl正交试验结果
[0091]
[0092] 通过形态学鉴定、生理生化鉴定和16S rDNA分子鉴定，确定上述筛选的菌株为霍 氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei) Sl 〇
[0093] 通过正交实验表所得结果得出木质素降解菌株Ml生长的最佳培养条件为pH = 6. 5,温度30°C，氮源为酒石酸铵，时间为6d，转速为180r/min。
【具体实施方式】 [0094] 二：本实施方式的一株木质纤维素类物质高效降解