种适量的rDEV Δ UL2-GFP， 吸附1~4小时；将1 μ g转移载体稀释于不含血清和抗生素的OPti-DMEM中，使混合液的 终体积均为50 μ L，室温孵育5min ;取2 μ L Lipofectamine 2000与48 μ L不含血清和抗生 素的opti-DMEM轻轻混匀，室温孵育5min ;将50 μ L Lipofectamine 2000稀释液分别滴加 到50yL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无 血清OPTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入0. 5mL无血清0ΡΤΙ-ΜΕΜ，将100 μ L Lipofectamine 2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37°C培养4h，弃去上清， 加入10%胎牛血清的[99培养基，置37°(：培养2411后，用1%胎牛血清的[99培养基换 液，置37°C培养3~5d。
[0042] 3)重组病毒的蚀斑纯化
[0043] 将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板CEF细胞，吸附1小 时后，弃去吸附液，铺上1 %的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下 观察无绿色荧光的蚀斑，挑选单个无荧光蚀斑于0. 5ml M199营养液中，冻融1次后，如此 进行蚀斑纯化3~4次，获得重组病毒并将该病毒命名为鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus，DEV)rDEVAUL2-H9株，该病毒株已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西 路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保 藏，保藏编号为=CGMCC No. 11497。
[0044] 4)重组病毒rDEV Δ UL2-H9的鉴定
[0045] 采用ORF C17F、ORF C17R引物进行PCR扩增鉴定，PCR产物测序证实，HA基因成 功插入到UL2基因内（见图3)。
[0046] 5)重组病毒rDEV Δ UL2-H9间接免疫荧光鉴定
[0047] 将重组病毒rDEV Δ UL2-H9及其亲本毒分别接种CEF，当细胞病变达80 %时，用间 接免疫荧光法检测HA基因的表达情况。
[0048] 间接免疫荧光步骤：弃去细胞培养液，用PBS (pH7. 2)轻洗细胞表面1次，然后每 孔加入冷甲醇，置室温固定10~15分钟，弃去甲醇，自然晾干；用PBS(pH7. 2)洗细胞面1 次，然后分别加入适当稀释的鸡抗DEV单特异性抗体、鸡抗H9单特异性抗体（均由本发明 人所在实验室制备、保存），置37°C作用1小时；弃去鸡抗REV单特异性抗体，用含0. 05% 吐温-20的PBS (pH7. 2)洗3次；每孔加入适当稀释的FITC标记的兔抗鸡IgG (购自SIGMA 公司），置37°C作用1小时；用含0. 05%吐温-20的PBS(pH7. 2)洗3次；在荧光倒置显微 镜下观察。鸡抗DEV单特异性抗体染色后，重组病毒rDEV △ UL2-H9及其亲本毒均出现了特 异性荧光；鸡抗H9单特异性抗体染色后，重组病毒rDEV △ UL2-H9出现了特异性荧光，而亲 本毒无荧光。结果表明，重组病毒在CEF中表达了 HA蛋白。
[0049] 6)重组病毒rDEV Δ UL2-H9病毒含量测定
[0050] 重组病毒rDEV Δ UL2-H9接种CEF，细胞病变达70 % -80 %时收获，冻融1次后用 CEF 测定病毒含量，为 105'2TCID5Q/0. lml。
[0051] 7)重组病毒rDEV Δ UL2-H9遗传稳定性试验
[0052] 重组病毒rDEV AUL2-H9病毒在CEF细胞上传代20代，取其第5代、第10代、第15 代和第20代毒应用PCR、间接免疫荧光检测，结果表明所获得的重组病毒rDEV △ UL2-H9在 CEF中稳定遗传、正确表达HA蛋白（见图4)。
[0053] (5)动物试验
[0054] 将15只4周龄SPF鸭，随机分成3组，每组5只。第1组肌肉注射rDEV Δ UL2-H9， 每只Ioootcid5。，第2组肌肉注射dev亲本毒，每只Ioootcid5。，第3组不免疫，作对照。每组 单独隔离饲养。在免疫后21天，翅静脉采血后，腿部肌肉注射接种DEV强毒（CVCC AV1221)， 每只1000MLD。观察14d，每天记录发病死亡情况。攻毒对照组100%死亡，免疫100%保护 (表2)，血清中H9HI抗体效价几何平均值为1:64 (表3)，说明rDEV Δ UL2-H9具有良好的免 疫原性。
[0055] 表2 DEV攻毒结果
[0056]
[0057] 表3 H9HI抗体检测结果
[0059] 2.疫苗制备及检验
[0060] (1)疫苗制备
[0061] 1)细胞制备选择发育良好的9~11日龄SPF鸡胚，按照常规胰酶消化法制成 CEF，培养24小时左右长成单层备用。
[0062] 2)病毒液的制备按体积比0. 01%~0. 5%的接毒量将生产种毒rDEVAUL2-H9株 接种CEF细胞单层，37~38°C培养36~72小时，当病变率达75%以上收获病毒液，-20°C 结冻保存。
[0063] 3)半成品的检验
[0064] ①无菌检验每组分别取样，按《中国兽药典》二〇一〇年版三部进行，应无菌生 长。
[0065] ②病毒含量测定每CL Iml病毒含量应^ 105'°TCID5。。
[0066] 4)配苗及分装将检验合格的病毒液过滤混合，加入适量的5%蔗糖脱脂奶稳定 剂和抗生素，充分混匀，定量分装。
[0067] 5)冻干分装后，按《中华人民共和国兽用生物制品规程》（中华人民共和国农业 部.中华人民共和国兽用生物制品规程2000年版，化学工业出版社，2001，437页以下称《规 程》）附录中的方法迅速进行冷冻真空干燥。
[0068] (2)疫苗检验
[0069] 本发明涉及到的相关检验方法按中华人民共和国兽药典（中国兽药典委员会.中 华人民共和国兽药典二〇一〇年版（三部）.中国农业出版社，2011，本发明称《中国兽药 典》）的方法进行。
[0070] 1)性状淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
[0071] 2)无菌检验按《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。
[0072] 3)支原体检验按《中国兽药典》进行检验，应无支原体生长。
[0073] 4)外源病毒检验按《中国兽药典》进行检验，应无外源病毒污染。
[0074] 5)鉴别检验将疫苗用灭菌生理盐水稀释至100TCIDm/0. lml，与等量抗鸭瘟病毒 特异性血清混合，置室温作用60分钟后，接种5个已长成CEF单层的细胞孔（48孔细胞板）， 每孔0.2ml，同时设病毒对照组，置37~38°C条件下，培养观察120小时。病毒对照组应全 部出现病变，中和组应不出现细胞病变。
[0075] 6)安全检验用2~4周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉接种疫苗10 羽份，观察14日，应全部健活。
[0076] 7)效力检验
[0077] ①鸭肠炎病毒部分下列方法任择其一。
[0078] 病毒含量测定按瓶签注明羽份，将疫苗稀释至每0.1 ml含1羽份，再继续作10倍 系列稀释，取3个适宜稀释度，分别接种5个已长成CEF单层的细胞孔（96孔细胞培养板）， 每孔0. lml，置37~38°C条件下，培养观察120小时。根据CPE产生情况，按Reed-Muench 法计算TCID5。。每羽份病毒含量应彡l(f5TCID5。。
[0079] 用鸭检验用2~8周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉注射接种疫苗1 羽份，另设5只不免疫作对照，在同样条件下隔离饲养。14日后，每只鸭肌肉注射1000MLD 鸭瘟病毒强毒（CVCC AV1221)，观察14日。对照鸭应至少4只死亡，免疫鸭应至少8只保 护。
[0080] ②H9亚型禽流感病毒HA蛋白部分下列方法任择其一。
[0081] 病毒含量测定按瓶签注明羽份，将疫苗稀释至每0.1 ml含1羽份，再继续作10倍 系列稀释，取3个适宜稀释度，分别接种5个已长成CEF单层的细胞孔（96孔细胞培养板）， 每孔0. lml，置37~38°C条件下，培养观察96小时。用间接免疫荧光染色方法检测重组鸭 肠炎病毒表达的H9亚型禽流感病毒HA蛋白。对照鸡胚成纤维细胞应无特异性荧光，根据 每孔绿色荧光情况，按Reed-Muench法计算FAID 5。。每羽份病毒含量应多l(f5FAID5。。
[0082] 用鸭检验用2~8周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉注射接种疫苗 1羽份，另设5只不免疫作对照，在同样条件下隔离饲养。21-28日后，每只鸭静脉注射 0. 1-0. 2ml H9亚型禽流感病毒（含IOsEIDJ。攻毒后第1日和第2日，采集每只鸭的喉拭 子于Iml PBS溶液（含1万单位双抗），将同一只鸭两日的喉拭子混合作为1个样品，每个 样品经尿囊腔接种10-11日龄SPF鸡胚，每胚0. 2ml，在37°C培养5日。每日照蛋1次，及 时取出死胚置2-8°C。培养结束时测定死胚、活胚尿囊液的血凝（HA)价，5枚胚中至少1枚 鸡胚的胚液的HA价不低于1:16时，判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1 代后再判定。免疫鸭应至少由8只病毒分离为阴性，对照鸭应至少有4只病毒分离为阳性。
[0083] 8)剩余水分测定按《兽药典》规定方法进行测定，应符合规定。
[0084] 9)真空度测定按《兽药典》规定方法进行测定，应符合规定。
【附图说明】
[0085] 图1载体pT-GFP-gpt示意图
[0086] 图2重组病毒rDEV Δ UL2-GFP的鉴定
[0087] 图3重组病毒rDEV Δ UL2-H9的鉴定
[0088] 图4重组病毒rDEV Δ UL2-H9遗传稳定性试验
[0089] 本发明涉及的微生物资源信息
[0090] 本发明涉及的微生物为：鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV) CVCC AV1221 株，又名鸭瘟病毒（中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版，中 国农业科学技术出版社，2002，pl38)保存于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品 监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心；经分子生物技术，将H9亚型禽流感病毒血凝素 (HA)基因插入到DEV UL2基因内，获得的重组缺失病毒，命名为H9亚型禽流感病毒重组鸭 肠炎病毒（rDEVAUL2-H9)，该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏编号为：CGMCC No. 11497。
[0091] 本发明的积极意义
[0092] 本发明构建了表达H9亚型禽流感病毒血凝素（HA)基因的重组鸭肠炎病毒 (rDEV Δ UL2-H9)，将该重组鸭肠炎病毒rDEV Δ UL2-H9株制备成活疫苗，可预防鸭瘟和H9 亚型禽流感；在构建过程中的缺失U L 2基因、携带绿色荧光标记的重组鸭肠炎病毒载体 (rDEV AUL2-GFP)，可通过同源重组的方法，应用该载体表达外源基因，为鸭肠炎病毒作为 载体构建抗鸭瘟和其他病原的新型重组疫苗打下基础。
[0093] 实施例
[0094] 以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。 [0095] 实施例1
[0096] --重组鸭肠炎病毒CrDEV Δ UL2-H9株）的构建
[0097] 本发明所述鸭肠炎病毒（rDEV Δ UL2-H9株）的构建方法如下：
[0098] (1)载体
[0099] PMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程（大连）有限公 司。含有CMV启动子、polyA的GFP报告基因载体pT-GFP-gpt (见图1)，由本发明人所在实 验室构建、保存。
[0100] ⑵引物设计
[0101] 根据GenBank上发表的DEV序列设计合成以下引物：见表1。
[0102] (3)含G