[0050] 表2本文中使用的互补突变核苷酸
[0051]
[0053] 1 · 4Rv0888 蛋白纯化
[0054] 收集4L含有pET-22b-Rv0888的Rosetta2(DE3)E.coli细菌培养物，菌体沉淀用 200mLbufferA(20mMTris-HCl, 150mMNaCl, 10%glycerol,pH8. 0)重悬，用高压破碎机 (ConstantsystemUSA, 30kpsi)在 4°C条件进行压力破碎，4°C1500rpm离心 30min收集沉 淀。沉淀用bufferA重悬超声（350W, 3s/3s, 4°C) 10min，4°C1500rpm离心 30min收集沉 淀。沉淀再用80mL2M尿素重悬，于4°C搅拌4h，4°C1500rpm离心30min在收集沉淀。沉 淀用 80mLbufferB(20mMTris-HCl, 150mMNaCl，6Murea, 20%glycerol,pH8.0)重悬， 于4°C条件下溶解过夜，4°C1500rpm离心30min，弃沉淀留上清。
[0055]上清用 2LbufferC(20mMTris-HCl，150mMNaCl，5Murea, 20%glycerol,ρΗ8· 0) 透析，每隔12h换一次透析液，尿素下降1M，其他成分不变，直到无尿素。透析后的蛋 白于 4°C条件下 15000rpm离心 30min。上清过NiSepharose6FastFlowresin(GE Healthcare)纯化柱，用 60mLbufferE(20mMTris-HCl, 500mMNaCl, 10%glycerol, 20mM imidazole,pH8. 0), 60mLbufferF(20mMTris-HCl, 500mMNaCl, 10 %glycerol, 40mM imidazole,pH8.0)和lOOmLbufferG(20mMTris-HCl, 1MNaCl,pH8.0)洗去未结合的 蛋白。用 5mLbufferH(20mMTris-HCl, 150mMNaCl, 10%glycerol300mMimidazole,pH 8.0)和 5mLbufferI(20mMTris-HCl，150mMNaCl，10%glycerol，500mMimidazole,pH 8. 0)洗脱目的蛋白。收集的蛋白用SDS-PAGE验证纯化效果。
[0056] 亲和层析纯化的蛋白的用30kDa的超滤管（Millipore)浓缩至2mL，浓缩的蛋白过 预先用bufferJ(20mMTris-HCl,pH8.0)平衡的HiLoad16/600Superdex200pg柱（GE Healthcare)，收集所有峰下的蛋白，用SDS-PAGE进行分析验证。验证的蛋白在浓缩至2mL 过预先用bufferJ平衡的ResourceS5mL柱（GEHealthcare)。目标蛋白用0M-2M的 NaCl线性洗脱。收集的蛋白用SDS-PAGE进行分析验证。
[0057] 1. 5Rv0888蛋白的质谱分析
[0058] 纯化的蛋白跑SDS-PAGE，将含有目的蛋白的胶块切下，切成1mm3左右的小块，装 入离心管中，水洗一次；然后用50% (V/v)ACN/25mM碳酸氢铵（100yL，pH8. 0)脱色15分 钟。反复3次，直至将颜色脱尽；在用蒸馏水洗涤1次；将胶块浸入30μL100%ACN中5 分钟，脱水，胶块变白，然后室温抽干；加8μLTrypsin酶液（0.lmg/ml)，37°C过夜16h左 右；将 0· 3uL已酶解的样品加 0· 3uL的基质（5mg/mLa-cyan〇-4-hydroxycinnamic-acid(F luka)in50% (v/v)acetonitrile(Fisher)andO. 1% (w/v)trifluoroaceticacid(DIMA)) 点到样品板上，室温晾干，用基质辅助的激光解析离子飞行时间质谱分析。选用正离子反射 模式进行质谱分析，结果用4000Series软件分析。利用以下参数：肽片段分子质量容许误 差（Precursortol.) :±0.2Da;二级片段容许误差（MS/MStol) :±0.8Da;酶解片段不完 全（missedcleavages) :1，搜索SwissProt同源数据库验证目的蛋白。
[0059] 1. 6Rv0888核酸酶底物
[0060] 为了检测重组核酸酶Rv0888对底物的特异性。10μL的反应体系，反应buffer 为：20mMTris-HCl, 5mMMgCl2,pH7. 5,分别加入 0· 2μg的线性dsDNA(PCR产物），环状质 粒DNA(pGEX-6p-l质粒），染色体DNA(大肠杆菌DNA)或者面包酵母RNA(Sigma-Aldrich) 与3yg纯化的Rv0888蛋白于37°C水浴锅中反应。Buffer(20mMTris-HClpH7. 5)代替 Rv0888蛋白作为阴性对照。60min之后，10yL的反应溶液加入1yL的10xloadingbuffer 跑1%的核酸胶电泳进行分析。所有的试验重复三次。
[0061] 1. 7二价离子和金属螯合剂对Rv0888活性的影响
[0062] 二价离子通常是脱氧核糖核酸酶或者是核酸酶所必须的。二价离 子对核酸酶活性的影响测定方法如下：Rv0888蛋白与5mM的不同二价离子盐 (CaCl2,MgCl2,MnCl2,BaCl2,NiCl2)和不同的二价离子盐组合（CaCl2+MgCl2,CaCl2+MnCl2,Mg Cl2+MnCl2)在37°C条件下反应lh。结果通过1%的核酸凝胶电泳进行分析。所有试验重复 三次。
[0063] 1· 8温度和pH对Rv0888活性的影响
[0064] 使用最佳的二价离子和20mMTris-HCl缓冲液（pH6.Ο-pH8. 0,间隔0. 5)，37°C 条件下反应lh检测不同pH对Rv0888活性的影响。使用最佳的二价离子和最佳的pH在 33°C-51°C(间隔2°C)的温度范围内检测不同温度对Rv0888活性的影响。所有的结果都 通过1%核酸凝胶电泳分析验证。Rv〇888的活性用之前报道的分光光度的方法进行定量。 200 以1^的反应体系：2(^1^(^反应131^€61(10〇11111^8-!1(：1，5〇1111〇3(：12,5〇1111111(：1 2，口!1 7.5) ;20yL环状质粒DNA(100ng/yLpGEX-6p-l) ;10yLRv0888 蛋白（lmg/mL) ;150yL 灭菌水。于37°C反应lh，加入8yL0. 5MEDTA以终止反应。反应混合物用灭菌水稀释至 2mL，用Nanophotometer?PealUltramicroUV-Visspectrophotometer测定 260nm〇 在 41°C条件下，每分钟降解底物的产物使260nm处吸光值增加0. 001所需要的酶量定义为一 个酶活力单位（U)。
[0065] 1. 9Rv0888核酸酶活性的动力学研究
[0066] 以小牛胸腺DNA和面包酵母RNA为底物，使用分光光度法测定Rv0888核酸酶米氏 动力学的参数。在41°C和pH6. 5条件下，10μg纯化的Rv0888蛋白与不同浓度的小牛胸 腺DNA(0. 00625mg/mL, 0· 0125mg/mL, 0· 025mg/mL, 0· 05mg/mL, 0·lmg/mL, 0· 2mg/mL, 0· 4mg/ mL, 0. 6mg/mL, 0. 8mg/mL；RNA:0. 00625mg/mL, 0. 0125mg/mL, 0. 025mg/mL, 0. 05mg/mL, 0.lmg/ mL)共同孵育。20mMTris-HCl(pH6. 5)代替Rv0888蛋白作为阴性对照。反应lh后，加 入终浓度5%冰的高氯乙酸，然后用灭菌水稀释至2mL。稀释后的溶液用Nanophotometer? PealUltramicroUV-Visspectrophotometer测定 260nm。所有试验重复三次。
[0067] 1. 10Rv0888抑制剂筛选
[0068] 使用以下中药单体筛选Rv0888的抑制剂：丹参素钠，天麻素，盐酸益母草碱，红景 天苷溶于水；橄榄苦苷，绿原酸，刺五加苷，6-姜酚，西红花苷，姜黄素，白藜芦醇，类叶升麻 苷，虎杖苷，松果菊苷，香叶木素，芦丁，根皮苷，黄芩苷，柚皮苷，杨梅素，水飞蓟素，蛇床子 素，藤黄素，新藤黄酸，大黄酸，葛根素溶于50 %乙醇；野漆树苷，补骨脂乙素，剑叶龙血素 C，甲氧醉椒素，格列喹酮，紫檀芪，姜黄醇，菊苣酸，龙血素B，盐酸罗格列酮，左旋紫草溶于 50%DMS0 ;α-倒捻子素，哈巴俄苷，阿魏酸松柏酯溶于50%甲醇。3μg纯化Rv0888蛋白 预先37°C条件下与0. 3mM不同中药单体孵育。对照用灭菌水，50%DMS0, 50%甲醇，或者 50%乙醇。活性参照以上所使用的测定方法。
[0069] 1.11肺部感染
[0070] 肺部感染试验使用5-6周龄SPF雌性BALB/c