65°C 保温30min，然后在4 °C下，10000g离心20min，取上清液加等体积的氯仿：异戊醇（ 24:1 )的混合物，轻轻摇勾30min以上，4 °C下、10000g离心20min;将上清液移入1.5mL 离心管后，加入2/3体积经-20 °C预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，用玻璃棒捞出DNA后，用 75%的乙醇洗涤2-3次，室温凉干后，溶于适量含20yg/mLRNase的TE，37 °C消化RNA30 min后即可到灵芝基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳结果显示:灵芝的基因组为单一条带，且大小 在10000bp以上（见图1 )。
[0025] 2、灵芝强启动子的克隆 以灵芝基因组DNA为模板，用P-gpd-F、P-gpd-R作为引物进行PCR扩增，扩增得到灵芝的 启动子P-gpd，引物序列如下： P-gpd-F:5，-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC- 3,， P-gpd-R:5 '-GCTAGCGTTGAGAGGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG-3'； PCR条件如下：95°C10min，95°C30s，55°C30s，72°C90s，72°C10min。[0026] 3、启动子P-gpd与PMD19-T连接 将克隆后的启动子P-gpd进行胶回收，将回收产物与PMD19-T用T4连接酶在16 °C进行 连接，得到PMD19-T-P中间载体。
[0027]4、灵芝终止子的克隆 以灵芝基因组DNA为模板，用引物T-sdhB-F:5，-ATGAGCGGGTCAGAGAGT- 3， T-sdhB-R:5 '-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT- 3 ' 进行扩增，得到440bp的序列；PCR条件为:95°C10min，95°C30s，55°C30s， 72°C30s，72°C10min〇
[0028] 5、终止子T-sdhB与PMD19-T-P连接 将克隆后的终止子T-sdhB胶回收，把PMD19-T-P中间载体用SacI单酶切，PCR回收酶切 产物，再用T4聚合酶补平酶切位点，然后再用T4连接酶在16 °C进行平末端连接，得到 PMD19-T-P-T中间载体。
[0029]6、cbx基因的克隆 以灵芝基因组DNA为模板，用引物 cbx-F:5'-TCTGCTCTTCCCGATTGCTGCATTTGT-3' cbx-R:5'-CTATGTCTTGCCTTGTCTCGCGTCAACC-3' 进行PCR得到灵芝的sdhB基因；PCR条 件为：95 °C 10 min，95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 90 s，72 °C 10 min;再设计一对定 点突变引物： sdhB-MR:5'-GAAGATCGTG4GGCAGCGGTATAGGC-3'（其中&为突变位点）sdhB-MF:5'-GCCTATACCGCTGCq；CACGATCTTC-3'（其中I为突变位点）。
[0030] 第一轮PCR用引物cbx-F和sdhB-MR进行扩增，PCR条件为：95°C10min，95°C 30s，58°C30s，72°C2min20s，72°C10min，得到片段sdhBl;第二轮PCR用引物 cbx-R和sdhB-MF进行扩增，PCR条件为：95°ClOmin，95°C30s，55°C30s，72°C1min 20s，72°C10min，得到片段sdhB2;获得相应片段后，采用重叠PCR的方法把两个片段连 接。第三轮重叠PCR的引物为cbx-F和cbx-R，扩增条件为:94 °C变性10min，66 °C退火30 s，72 °C延伸4min，共35个循环，最后72 °C延伸10min。最终获得了3171bp突变的灵芝 sdhB基因序列（定点突变后对carboxin抗生素产生抗性，我们把定点突变后的sdhB基因 定义为cbx)。经序列测定后确认相应位点已经突变。
[0031]7、将突变的cbx基因插入到PMD19-T-P-T的Pst頂每切位点 将PMD19-T-P-T载体用PstI酶在37 °C下，单酶切2h，回收酶切后的片段，用T4聚合酶 补平酶切位点，再用T4连接酶在16 °C下把cbx基因与回收后的片段进行连接，即得到pJW-EXP载体（见图2 )。
[0032]实施例2:pJW-EXP_LS载体的构建 1、LS基因的克隆 以灵芝基因组DNA为模板，用引物 LS-Nhe-F:5，-GCTAGCATGGCAGCGTACGCCCCG- 3， LS-Sma-R:5 '-CCCGGGCTACTTCTTGGCGTGCAACTCCTTG- 3'； 进行PCR得到LS基因；PCR条件为:95°C10min，95°C30s，61°C30s，72°C4min10s，72°C10min(见图3 )。
[0033] 2、将LS基因插入到pJW-EXP载体 将pJW-EXP载体用Smal和Nhel双酶切，回收酶切后的片段，用T4连接酶在16 °C下，将LS基因插入到pJW-EXP载体的Nhel和Smal之间即得到pJW-EXP-LS载体（见图4 )。
[0034]实施例3:通过PEG介导原生质体融合的方法，将pJW-EXP-LS转化到野生型灵芝细 胞中 1、灵芝原生质体的制备及转化 先用溶壁酶将野生型灵芝菌丝制备成原生质体，然后将灵芝原生质体悬浮在100yL的STC( 0.55Μ的山梨醇，10mM的CaCl2，10mM的Tris-HCl缓冲液，pH为7.5 )中，再加入 1Pg的质粒DNA和PTC缓冲液（60% 的PEG4000 (W/V)，10mM的Tris-HCl缓冲液，pH为 7.5,50mM的CaCl2 );在冰上培养10min，再加入1mL的PTC缓冲液混合均匀并在室温培 养20min;用10mL融化的CYM固体培养基与转化后的原生质体混合倒平板并加入carboxin 使carboxin的终浓度为2mg/L;在30 °C下培养10天后可长出若干单菌落。
[0035] 2、在含有carboxin抗性的平板上传代培养 把单菌落转移到含有2 mg/L的carboxin的CYM平板中，在30 °C下传代培养约7天;经过3次在抗性平板上传代可获得稳定的转化子，用CTAB法提取转化后的灵芝基因组，具体操作 步骤见实施例1步骤1。分别以转化后的灵芝基因组、PJW-EXP-LS质粒（阳性对照）、野生 型（WT)灵芝基因组、水（阴性对照）为模板，用 LS-gpd-F:5'_ AACAATCACGATGGTCCCG- 3' LS-gpd-R:5'_ GAACGAGCGATGTAGTCAGG- 3' 作为验证引物进行PCR，PCR条件为：95°C10min，95°C30s，55°C30s，72°C 2 min，72°C10min(见图5 )。由于P-gpd和LS基因在真菌表达载体pJW-EXP-LS中连接 在一起，以LS-gpd-F(位于灵芝gpd基因的启动子上）和LS-gpd-R(位于灵芝LS基因 上）为引物和基因组DNA为模板进行PCR，能够扩增出约3500bp条带的菌株即可认为是导 入了LS基因的转基因灵芝。如图5所示，从转基因菌株和阳性对照上能够扩增出约3500bp 的条带，而野生型中没有出现此条带，只出现了一些非特异性条带。结果表明：LS基因确实 整合到了灵芝基因组上。
[0036]3、斜面培养 将阳性转化子转移到固体PDA培养基中（含有2mg/L的carboxin)，在28 °C下培养 5-7 天。
[0037] 4、一级种子培养 在250mL摇瓶中添加40mL种子培养基和10mL菌丝体悬液（从一支斜面中获得）， 并在28 °C，120rpm下培养5天。
[0038]5、二级种子培养 在250mL摇瓶中加入45mL种子培养基和5mL-级种子培养液（大约500mgDW/L， 一级培养物用玻璃珠打碎后接种），在28 °C，120rpm下培养2天。
[0039] 6、发酵培养 在250mL摇瓶中加入45mL发酵培养基和5mL二级种子发酵液（大约500~600mg DW/L，二级培养物用玻璃珠打碎后接种），在28 °C，120rpm下培养。
[0040] 7、单体灵芝酸的分离和提取 准确称取干细胞粉末100mg，加入3mL70%(v/v)乙醇浸泡过夜，超声处理3次，每次30mirulOOOOrpm离心5min后获得上清液。在50 °C烘箱中烘干。用200yL色谱级甲醇彻底溶 解，用0.22μπι滤膜过滤。用HPLC检测灵芝酸单体。HPLC检测条件为:HPLC色谱柱为C18柱 (Agilent1200series，5μπιAgilentZorbaxSB-C18column，250X4.6mm);进样量 20 yL;流速1mL/min;流动相A为甲醇/乙酸（100:0.5(v/v))，流动相B为超纯水，0-20min:A 相为80%-100%等梯度洗脱;20 11^11-30 11^114相为100%洗脱;30 11^11-35 11^114相为80 %洗脱；紫外检测波长为245nm;洗脱时间35min。记录相应的峰面积和出峰时间。按照标 准曲线计算出各个灵芝酸单体的浓度和含量。
[0041] 通过摇瓶发酵实验表明，LS转化子菌株产单体灵芝酸GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S的 含量分别是WT菌株的2.1，1. 6，2.35，1.3倍。在同等情况下，使用本发明构建的工程菌株可 以节约劳动力，缩短生产周期，降低成产成本。因此，本高产菌株可以作为生产灵芝酸的工 程菌株，适用于工业化生产，具有广泛的应用前景。
【主权项】
1. 一种灵芝酸高产工程菌株Kmust-LS，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心的保藏编号为CGMCCNO. 11603。
【专利摘要】本发明公开一种灵芝酸高产工程菌株Kmust-LS，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC？NO.11603，本发明提供的灵芝工程菌，是通过选用灵芝强启动子P-<i>gpd</i>过表达编码羊毛甾醇合酶LS基因，得到高产灵芝酸灵芝工程菌Kmust-LS；通过摇瓶发酵实验表明，该菌在其细胞生长不受影响的情况下，单体灵芝酸GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S分别是WT菌株的2.1，1.6，2.35，1.3倍，因此，本高产菌株可以作为生产灵芝酸的工程菌株，具有广泛的应用前景。CGMCC NO.1160320151116
【IPC分类】C12N1/15, C12R1/645
【公开号】CN105462865
【申请号】CN201610001941
【发明人】徐军伟, 张德怀, 李焕军
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月6日