p样品杯于105°C烘箱干燥30min，取出转移到干燥器内，冷却至5min后， 称重（即为W1)。准确称取2.000g(即为W2)液体发酵后的样品置于FiberCap样品杯中，将样 品杯放入浸提烧杯，加入400mL中性洗涤剂和lmL十氢化萘及2g无水亚硫酸钠。将烧杯套上 冷凝装后置于加热板上，煮沸l〇min，持续微沸60min。煮沸完毕后，用新鲜的热水重复洗涤 三次。将样品杯放入烘箱中130°C烘干2h后，在干燥器中冷却至室温，称重（即为W3)。
[0136] 2.3.2、酸性洗涤纤维(ADF)测定
[0137]将上述烘干称重后含有中性洗涤纤维的FiberCap样品杯置于浸提烧杯中，加入 100mL酸性洗涤剂和lmL十氢化萘及2g无水亚硫酸钠。将烧杯套上冷凝装后置于加热板上， 煮沸lOmin，持续微沸60min。煮沸完毕后，用新鲜的热水重复洗涤三次。将样品杯放入烘箱 中130°C烘干2h后，在干燥器中冷却至室温，称重（即为W4)。
[0138] 2.3.3、酸性洗涤木质素(ADL)测定
[0139]将上述烘干称重后含有中性洗涤纤维的FiberCap样品杯置于浸提烧杯中，加入 72%硫酸，20°C消化3h后过滤，用新鲜的热水重复洗涤三次。将样品杯放入烘箱中130°C烘 干2h后，在干燥器中冷却至室温，称重（即为W5)。
[0140] 2.3.4、酸不溶灰分(AIA)测定
[0141]将样品杯置于预干燥并称重(W6)的灰化坩埚(45X60mm)中，在马弗炉中600°C灰 化4h。待坩埚缓慢冷却至大约200°C时，取出放于干燥器;冷却至室温后称重(W6)。
[0142]将所得数据通过SPSS19.0软件分析，利用Duncan法进行多重比较，结果以标记字 母法标明各菌株的显著差异性。各计算公式如下：
[0143]中性洗涤纤维(NDF)含量：
[0144] NDF(%)= (W3-ffl)/W2X100%；
[0145] 酸性洗涤纤维(ADF)含量：
[0146] ADF(%) = (W4-W3)/W2X100%；
[0147] 酸性洗涤木质素(ADL)含量：
[0148] ADL(%)=W5/W2X100%；
[0149]半纤维素(Hemicellulose)含量：
[0150] Hemicellulose(%) =NDF(%) -ADF(%)；
[0151]纤维素(Cellulose)含量：
[0152] Cellulose(%)=ADF(%)-W5/ff2X100%；
[0153]木质素(Lignin)含量：
[0154]Lignin(%)=W5/W2X100% -W6/W2X100%；
[0155] 2.4结果与分析
[0156] 2.4.1木质素、纤维素和半纤维素含量测定
[0157]玉米秸杆经菌株发酵处理30d后，纤维素、半纤维素和木质素含量测定结果如表10 和图8所示。
[0158]表10菌株降解后玉米秸杆中各组分平均含量
[0159]
[0160]注:空白对照组不接入菌种，阳性对照组接入5%中农绿康(北京)生物技术有限公 司生产的复合微生物菌剂。采用Duncan法进行多重比较。显著性水平p= 0.01和p= 0.05分 别以大小写字母表示，n= 3。
[0161] 由表10和图8可知，玉米猜杆经肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252发 酵处理30d后，木质素含量为9.02±4.43%，均小于空白对照组和阳性对照组中玉米秸杆木 质素含量；以显著水平P= 〇 .05分析，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252发酵 处理的玉米秸杆中木质素含量与空白对照组玉米秸杆中木质素含量比较差异不显著，与阳 性对照组玉米秸杆中木质素含量比较差异不显著；以显著水平p= 〇.01分析，肺炎克雷伯氏 菌(Klebsiellapneumoniae)L252发酵处理的玉米猜杆中木质素含量与空白对照组玉米猜 杆中木质素含量比较差异不显著，与阳性对照玉米秸杆组中木质素含量比较差异不显著； 说明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252可以降解木质素。
[0162] 玉米秸杆经液体发酵30d后，纤维素含量为33.65 ± 2.59 %，均大于空白对照组和 阳性对照组中玉米秸杆纤维素含量；以显著水平P= 0.05分析，肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiellapneumoniae)L252发酵处理的玉米猜杆中纤维素含量与空白对照组玉米猜杆 中纤维素含量比较差异不显著，与阳性对照组中玉米秸杆纤维素含量比较差异不显著；以 显著水平P= 〇.01分析，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252发酵处理的玉米猜 杆中纤维素含量与空白对照组中玉米秸杆的纤维素含量比较差异不显著，与阳性对照组中 玉米猜杆的纤维素含量比较差异不显著;说明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae) L252不能降解纤维素。
[0163]玉米秸杆经液体发酵30d后，半纤维素含量为24.33 ± 2.61 %，大于空白对照组中 玉米秸杆半纤维素含量，小于阳性对照组中玉米秸杆半纤维素含量；以显著水平P= 〇.05分 析，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252发酵处理的玉米猜杆中半纤维素含量 与空白对照组玉米秸杆中半纤维素含量比较差异不显著，与阳性对照组玉米秸杆中半纤维 素含量比较差异显著；以显著水平P= 〇.〇1分析，肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneUm〇niae)L252发酵处理玉米秸杆中的半纤维素含量与空白对照组玉米秸杆中半纤维素 含量比较差异不显著，与阳性对照组玉米秸杆中半纤维素含量比较差异不显著；说明肺炎 克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252不能够降解半纤维素。
[0164] 肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252具有木质素降解能力，可以高效 降解木质素。作为单一菌株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252对木质素的降 解能力强于复合微生物菌剂，经复合微生物菌剂发酵处理的玉米秸杆中木质素含量是经肺 炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252发酵处理的玉米猜杆中木质素含量的1.3倍。
[0165] 2.5结论
[0166] 经【具体实施方式】一筛选出的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)L252具有 木质素降解能力，可以高效降解木质素。经复合微生物菌剂发酵处理的玉米秸杆中木质素 含量是经肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)L252发酵处理的玉米猜杆中木质素含 量的1.3倍，作为单一菌株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)L252对木质素的降解 能力强于复合微生物菌剂。
[0167] 3、全氮、全磷、全钾、速效磷和速效钾测定
[0168] 3.1、材料与试剂
[0169] 3.1.1、培养基
[0170]液体发酵培养基：葡萄糖5g，蛋白胨2g，NH4N03 1.0g，CaCl20.2g，K2HP〇40.5g， FeCl30.02，MgS〇4.7H200.5g，NaCl l.Og，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
[0171] 摇瓶发酵基础培养基：蛋白胨2g，NH4N03 1.0g，CaCl20.2g，K2HP〇40.5g，FeCl3 0.02，MgS〇4.7H200.5g，NaCl l.Og，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
[0172] 3.1.2、玉米秸杆粉
[0173] 玉米秸杆于2012年10月取自黑龙江省哈尔滨市黑龙江大学呼兰校区本实验室试 验田，烘干，粉碎过40目筛，备用
[0174] 3.2、试验方法
[0175] 3.2.1、液体发酵
[0176] 将【具体实施方式】一筛选出的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252接种 到液体发酵培养基中制成〇D6Q() = 0.5的菌悬液，然后以5 % (mL/mL)接种量将菌液接入含有 7.5 %玉米秸杆粉的摇瓶发酵基础培养基中，玉米秸杆粉使用间歇灭菌法灭菌，121°C湿热 灭菌30min，每个菌株设三次重复，37°C180r/min振荡培养30d，采用冷冻真空干燥法进行干 燥。设置一组空白对照组和一组阳性对照组，即空白对照组不接菌种，阳性对照组接入5 % (g/mL)菌剂，其他操作均与上述操作相同。
[0177] 3.2.2、试样溶液制备
[0178] 试样溶液参照中华人民共和国农业行业标准NY525-2012进行，但有所改进。
[0179]精确称取3.2.1中冷冻干燥后的试样0.5g(精确至0.001g)，置于凯氏烧瓶底部，用 少量水冲洗沾附在瓶壁上的试样，加5mL硫酸和1.5mL过氧化氢，小心摇匀，瓶口放以弯颈小 漏斗，放置过夜，在可调电炉上缓慢升温至硫酸冒烟，取下，少冷加15滴过氧化氢，轻轻摇动 凯氏烧瓶，加热l〇min，取下，稍冷后在家5滴~10滴过氧化氢并分次消煮，直至溶液呈无色 或淡黄色清液后