ting，结果如下： 1)MDR1和CYP19A1基因特异引物于UCSC中进行Blast，所有引物的扩增片段均覆盖了相 应的检测位点，无其它同源基因，MDR1_C1236T扩增片段位于chr7:87179522-87179674,长 度为153bp，扩增序列图如图1;MDR1_G2677T/A扩增片段位于chr7:87160475-87160699,长 度为225bp，扩增序列图如图2 ;MDR1_C3435T扩增片段位于chr7:87138602-87138791，长度 为 190bp，扩增序列图如图3; CYP19Al_rs4646扩增片段位于chrl5: 51502778+51502903,长 度为126bp，扩增序列图如图4。
[0023] 2)使用表1中SNaPshot PCR引物，SNaPshot法进行检测，结果如图5所示，各产物峰 的相对位置及测序反应掺入的碱基与预期相符。
[0024] 实施例三、MDR1和CYP19A1基因多态性的检测 1)提取EDTA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit(购自 T iagen，货号DP318 )的说明书，将DNA样品稀释至1 OOng/yL，备用。
[0025] 2)配制PCR扩增引物混合物：将PCR扩增引物中MDR1_C1236T、MDR1_G2677T/A、 MDR1_C3435T和CYP19Al_rs4646的引物浓度比为1:1:1:1混合，震荡混匀；短暂离心后备用； PCR扩增采用Q5?热启动超保真2X Master Mix(购自NEB公司，货号M0494L)，反应体系如表2 所示，震荡混匀，短暂离心后，分装18.0此至标记好的PCR反应管;往标记好的PCR反应管加 入引物混合物5.0yL，按照以下程序进行PCR扩增:阶段1:98°C 3min;阶段2:98°C 10s;阶段 3:58°C 30s;阶段4:72°C lmin;阶段5:返回到阶段2,2:9个循环;阶段6:72°C 5min;阶段7: 25°C保温。
[0026] 表2、PCR试剂配制表格
3)按 MDR1_C1236T、MDR1_G2677T/A、MDR1_C3435T 和 CYP19Al_rs4646 的引物浓度比为 1: 1:1:1混合，SNaPshot PCR产物中加入1. OyL SAP酶，按照以下程序进行反应:37°C，15min; 80°C，15min;4°C，保温。反应完毕后，毛细管电泳技术进行检测，对检测结果采用 GENEMAPPERID V4.1软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图5所示。
[0027] 实施例四、检测MDR1和CYP19A1基因多态性的方法的特异性 本发明的检测特异性定义为阴性符合率。本发明共对19例样本进行SNaPshot测序法检 测，检测结果采用片段分析法或Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出的阴性结 果Sanger测序法显示的结果相符，如表3和表4所示。本发明的检测特异性为100%。
[0028] 表3、MDR1 3SNPs检测特异性数据
表4、CYP19A1 rs4646检测特异性数据
实施例五、检测MDR1和CYP19A1基因多态性的方法的灵敏度 本发明的检测灵敏度定义为阳性符合率。本发明共对19例样本进行优化SNaPshot测序 法检测，检测结果采用片段分析法或Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出的阳 性结果与Sanger法显示的结果相符，如表5和表6所示。本发明的检测灵敏度为100%。
[0029]表5、MDR1 3SNPs位点检测灵敏度的试验数据
表6、CYP19A1 rs4646位点检测灵敏度的试验数据
实施例六、检测MDR1和CYP19A1基因多态性的方法的准确度 本发明准确度定义为不同方法检测结果的一致性。本发明共对19例样本进行优化 SNaPshot测序法检测，检测结果采用片段分析法或Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序 法检测结果与片段分析法或Sanger法显示的结果相符，如表7所示。本发明的准确度为 100%〇
[0030] 表7、MDR1和CYP19A1基因准确度的试验数据
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种同时检测MDR1和CYP19A1基因多态性的引物，其特征在于:包括PCR扩增引物和 SNaPsho t PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对MDR1 _C 1 236T的上游引物5 ' -TCAGTTCCTATATCCTGTGTCTGTGAA-3 ' 和下游引物5 ' - GCTGGACTGTTGTGCTCTTCC-3 '，针对 MDR1_G2677T/A的上游引物5 ' - CCCATCATTGCAATAGCAGGAGT-3 ' 和下游引物5 ' -GCATGAAAAAGATTGCTTTGAGGA-3'，针对MDR1_C3435T 的上游引物5'-GATGGCAAAGAAATAAAGCGACTG-3 ' 和下游引物5 ' - ACTCGATGAAGGCATGTATGTTG-3 '，针对 〇丫？19八1_『84646的上游引物5'-1'〇八八八0'(：1^66(：(：1'(^6(：1'1'1'-3'和下游引物5'-TGGCCCATGGCATTTTATAGG -3' ；所述SNaPshot PCR引物包括：针对MDR1_C1236T的SNaPshot PCR引物5 ' -CTCTGCACCTTCAGGTTCAG-3 '，针对MDR1_G2677T/A的SNaPshot PCR引物5 ' -TTTTTTATTTAGTTTGACTCACCTTCCCAG-3 '，针对MDR1_C3435T的SNaPshot PCR引物5 ' -TTTTTTTTTTTTTTTGTTGGCCTCCTTTGCTGCCCTCAC-3'，针对CYP19Al_rs4646的SNaPshot PCR引 物5'- TTTTTTTTTTTTTTTTCTATGGGTTGTCACCAAGCTAGGTGCTATT-3'。2. 根据权利要求1所述的同时检测MDR1和CYP19A1基因多态性的引物，其特征在于：所 述 PCR 扩增引物中 MDR1_C1236T、MDR1_G2677T/A、MDR1_C3435T 和 CYP19Al_rs4646 的引物浓 度比为1:1:1:1，所述SNaPshot PCR引物中MDR1_C1236T、MDR1_G2677T/A、MDR1_C3435T和 CYP19Al_rs4646的引物浓度比为1:1:1:1。3. -种同时检测MDR1和CYP19A1基因多态性的方法，其特征在于:包括如下步骤： S1提取DNA样品； S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR 扩增，并对扩增产物进行纯化； S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshot PCR引物 进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化； S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。4. 根据权利要求3所述的同时检测MDR1和CYP19A1基因多态性的方法，其特征在于：所 述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。5. 根据权利要求3所述的同时检测MDR1和CYP19A1基因多态性的方法，其特征在于：所 述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括:阶段1:98°C 3min;阶段2:98°C 10s;阶段3:58°C 30s;阶段4:72°C lmin;阶段5:返回到阶段2,29个循环；阶段6:72°C 5min;阶段7:25°C保 温。6. 根据权利要求3所述的同时检测MDR1和CYP19A1基因多态性的方法，其特征在于：所 述步骤S3中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括:阶段1:96°C 10s;阶段2:55°C 5s;阶段3: 60°C 30s;阶段4:返回到阶段1，25个循环;阶段5:4°C保温。7. 根据权利要求3所述的同时检测MDR1和CYP19A1基因多态性的方法，其特征在于：所 述步骤S4中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。8. 根据权利要求1所述的同时检测MDR1和CYP19A1基因多态性的引物在制备检测MDR1 和CYP19A1基因多态性试剂中的用途。
【专利摘要】本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测MDR1和CYP19A1基因多态性的引物及其方法。本发明提供的MDR1和CYP19A1基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot？PCR引物。本发明提供的MDR1和CYP19A1基因多态性的引物具有特异性强，检测灵敏度好，准确性高的优点，实现了MDR1和CYP19A1基因多态性的检测，可以有效的预测绝经期晚期乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂的治疗疗效；同时还可以预测多种抗肿瘤药物与免疫抑制剂疗效及不良反应风险。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105525006
【申请号】CN201610043853
【发明人】梁耀铭, 于世辉, 赵薇薇, 燕启江, 胡昌明, 罗锦霞
【申请人】广州金域检测科技股份有限公司
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年1月22日