一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇荧光探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及应用探针技术，具体设及一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇巧 光探针及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 琉基(-SH)是细胞中化学活性很高的基团。生物体中存在许多蛋白质和非蛋白质 琉基化合物，如还原型谷脫甘肤(GSH)和半脫氨酸(CYS)等，它们具有重要的生理功能。而运 些硫醇水平的异常与许多疾病有关。谷脫甘肤是细胞内含量最丰富的硫醇，作为机体内重 要的生物活性琉基化合物，谷脫甘肤在维持生物体内正常氧化还原反应、细胞信号的转导、 基因调控等方面发挥着至关重要的作用。更重要的是，还原型谷脫甘肤能够清除体内的有 害毒物和代谢产物，维持细胞膜的完整性，减少自由基对DNA的攻击，从而减少DNA的损伤和 突变。谷脫甘肤还参与高铁血红蛋白的还原作用，及促进铁的吸收等。细胞内谷脫甘肤的浓 度（1~IOmM)远远高于细胞外水平(2uM)。人体许多疾病的产生都与谷脫甘肤的缺乏有关， 如:肝损伤、癌症、艾滋病、神经退行性疾病等。因此，快捷、方便、准确、灵敏地测定生物体内 的谷脫甘肤含量，始终备受人们的高度重视。
[0003] 在各种分析方法中，巧光检测由于其简单、方便、成本低、灵敏度高和其潜在的细 胞内成像等特性，已被证明是一种非常实用的检测方法。目前，许多有机反应已被用于硫醇 巧光探针的合成，如醒和氨基之间的环化反应、迈克尔加成反应、2,4-二硝基苯与硫醇的裂 解反应、亲和取代反应、二硫化物交换反应、Cu 2+络合物脱金属反应等。一种方法是基于 ChemodosimetriC反应的分子探针，但运种方法需要较长的解育时间，通常为20分钟到1个 小时甚至更长时间，实用性较低。另一种方法是利用Cu 2+与-甜的高亲和力来设计巧光探针。 运种反应大多发生在1毫秒之内，因此，预计可用于临床检测。由于硫醇与化的特异性亲和 力，使其探针有较高的灵敏度，同时也提高了此方法用于各种巧光探针设计的可能性。
[0004] 香豆素是巧光成像探针使用最广泛的巧光基团之一。由于它们较强的巧光强度、 优良的溶解性、高效的细胞渗透性和易于制备等优点，使其成为非常有吸引力的原始巧光 材料。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫 醇巧光探针及其制备方法和应用，新的巧光探针化合物1-Cu 2+。作为前体的化合物1是化合 物2 (香豆酷阱)和2，6-化晚二甲醒化合而成。化合物1与Cu2+配位，制备成化合物1 -Cu2+。化 合物1有较强的巧光，而化合物1-化2Tl乎没有巧光。当加入含琉基氨基酸后，化合物I-Cu 2+ 的巧光恢复，而加入不含琉基的氨基酸后，化合物1-化h的巧光强度几乎没有改变。因此，化 合物1-化可用于检测硫醇，例如:如谷脫甘肤。甚至可应用于细胞成像中。
[0006] 本发明的技术方案是:一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇巧光探针的制备 方法，化合物2即香豆酷阱和2,6-化晚二甲醒化合制得化合物I即香豆素类席夫碱衍生物， 化合物1与化配位，制备成硫醇巧光探针即化合物1-化2+。
[0007] 本发明的进一步改进包括：
[000引将0.3028g的化合物2( 1. Immol)溶于最少量的乙醇中，加入0. 0676g的2，6-化晚二 甲醒(0.5mmol);氮气保护下，加热回流12小时;冷却后有沉淀析出，得到的纯净物即为化合 物1。
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇巧光探针， 按照上述的方法制得。
[0010] 本发明还提供了一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇巧光探针的应用，具体 是在检测琉基氨基酸中的应用。
[0011] 所述的应用，具体是在检测谷脫甘肤中的应用。
[0012] 所述的应用，具体是用于生物体内硫醇化合物的检测。
[0013] 本发明进一步提供了一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇巧光探针的应用， 在活细胞中谷脫甘肤成像中的应用。
[0014] 所述的应用，具体是在人子宫颈鱗癌细胞中成像的应用。
[001引本发明用香豆酷阱和2,6-化晚二甲醒合成了一种新的化合物1，当化合物1与Cu2+ 配位后，制备出硫醇巧光探针，即化合物I-Cu2+。巧光光谱测试表明：在C曲CN:肥PES (3:2，v/ V)溶液中，该探针对硫醇具有很好的选择性和灵敏性，尤其是对GSH。除此之外，探针还具有 良好的细胞膜渗透性和低的细胞毒性，可用于活细胞中GSH成像，将有望用于临床上GSH的 检测。
【附图说明】
[0016] 图1是在C出CN:肥阳S(3:2，v/v)溶液中，随着Cu2+的加入，化合物1(10皿ol/u的紫 外光谱。嵌入图：在440nm处，化合物1的紫外可见滴定光谱。
[0017] 图2是在C出CN:肥阳S(3:2，v/v)溶液中，随着Cu2+的加入，化合物1(10皿ol/L)的巧 光光谱。嵌入图：在485nm处，化合物1的巧光滴定光谱(激发:440nm)。
[001引图3是在C出CN:肥阳S (3:2，v/v)溶液中，随着GSH的加入，化合物1 -Cu2+ (10皿01 /L) 的巧光响应。嵌入图：在485nm处，化合物1-化的巧光滴定光谱(激发:440皿）。
[0019] 图4是化合物1-化2+(10wiio1/L)对不同氨基酸的巧光响应强度(发射:485皿)。第一 栏代表加入不同氨基酸后的巧光强度;第二栏代表同时加入GSH和非琉基氨基酸后的巧光 强度。
[0020] 图5a是在Si化细胞中，化合物1的巧光成像。
[0021] 图化是在Si化细胞中，化合物1-化的巧光成像。
[0022] 图5c是在Si化细胞中，化合物1-化h+G甜的巧光成像。
[0023] 图5d是在Si化细胞中，化合物1的明场。
[0024] 图5e是在Si化细胞中，化合物1-化的明场。
[0025] 图5f是在Si化细胞中，化合物1-化h+G甜的明场。
[0026] 图6是化合物1的氨谱。
[0027] 图7是化合物1的碳谱。
[0028] 图8是化合物I的质谱。
[0029] 图9是化合物1(10皿ol/L)在C出CN:肥PES(3:2，v/v)溶液中，对各种金属离子的紫 外可见吸收光谱。
[0030] 图10是化合物1(10皿ol/L)在C曲CN:肥阳S(3:2，v/v)溶液中，对各种金属离子的 巧光光谱响应。
【具体实施方式】
[0031 ]下面结合附图对本发明做详细说明。
[0032]实施例1 [00削试剂
[0034] 4-二乙基氨基水杨醒，丙二酸二乙醋，赃晚，80%水合阱，2,6-化晚二甲醒，各种金 属离子的高氯酸盐他 3+，Ag+，Fe]+，r，Na+，Mg2+，Pb2+，Cah，呢2+，Mn2+，Cd2+，Fe2+，Zn2+，Ni 2+，C〇2 + ,Cu2+)的水溶液(2.OX I(T2M),各种氨基酸的水溶液(2.OX I(T2M),无水乙醇，乙腊(色谱 纯），二甲基甲酯胺(分析纯），肥阳S(抑:7.35-7.45)溶液等。
[0035] 合成过程
[0036] 合成过程式1所示:7-N，N-二甲基氨基-2-氧-2H-3-香豆酸醋(化合物3)和化合物2 是现有技术合成的。化合物1是由化合物2和2,6-化晚二甲醒合成，并通过氨谱、碳谱、质谱 进行表征（图6,7,8)。化合物I-Cu 2+是由化合物1与Cu(Cl〇4)2 ? 6出0制备的。
[0037]
[003引化合物1对化的紫外可见吸收和巧光光谱响应
[0039] 在C出CN:肥阳S(3:2，v/v)溶液中，化合物1(10皿ol/U的紫外可见吸收光谱如图1 所示，最大紫外吸收在440nm处。随着Cu(Cl〇4)2