2的系统发育树；
[0029] 图2. SDS-PAGE检测新型0-葡聚糖酶的纯度；
[0030] 图3.新型0-葡聚糖酶质谱图。
[0031] 海洋芽抱杆菌N6-2,拉下文名称为Bacillus sp.N6-2,2014年11月23日保藏于中 国武汉典型培养物保藏中屯、，保藏地址:武汉市武昌塔挪山武汉大学，保藏号为CCTCC NO: M2014586。
【具体实施方式】
[0032] 下面通过实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不受实施 例任何形式的限制。
[0033] 实施例1菌株N6-2的形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析
[0034] (1)形态特征
[0035] 革兰氏染色结果显示，菌株N6-2为革兰氏阴性菌，且具有明显的芽抱，菌体形态呈 现短杆棒状，多是有两个菌体相连。菌落特征为白色或者是乳黄白色，表面光滑，有突起。扫 描电镜图片显示，菌株N6-2呈现短杆棒状，菌体表面光滑，两端呈现突起，部分刚分裂的菌 体呈现大豆状，大部分菌体处于二分裂状态，两个菌体相连，且中间凹陷，连接处细长，菌体 间有粘膜产生。单个菌体的大小为宽:0.9-1.5皿，长:1-3.7皿。
[0036] (2)生理生化反应特征
[0037] 由于该菌为革兰氏阴性菌，故可W用API 20E细菌鉴定系统进行生理生化分析。结 果见表1。
[0038] 表1.菌株N6-2的生理生化鉴定结果
[0039]
[0040] 注：表阴性；'V'表示阳性
[0041] API 20E结果显示阳性：巧樣酸钢利用、色氨酸水解、Kohn明胶水解、发酵利用阳 性:薦糖产酸，氧化酶反应。
[0042] (3)168 rDNA序列分析
[0043] 吸取1.5mL的处于对数生长期的N6-2菌液，4°C，10000巧m，离屯、lOmin。弃上清液， 加入4(K)化的TE缓冲液，用枪头将沉淀吹打均匀，加入10化的溶菌酶，混合均匀，置于37 °C水 浴中90min，4°C，1OOOO巧m，离屯、1 Omin，保留上清即为DNA溶液。
[0044] 采用16S rDNA通用引物，由上海生工生物工程合成。正向引物：27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3'，反向引物：1492R 5'-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3' ； 16S rDNA序列 的 PCR 条件是:95°C 预变性 5min;95°C 变性 4〇3,55°(：退火1111111，72°(：延伸9〇3，循环30次，721： 延伸IOmin。PCR反应体系是:反应体系：2扣L，模板DNA: 0.5化，上游引物:2化，下游引物: L，10X easy tap buffe;r:5liL，dNTP:4liL，Easy tap DNA polymerase:0.5]iL，双蒸水：1 化L。
[0045] 用1.5%的琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，WD2000Marker为标准分子量对照试剂。 菌株N6-2的16S rDNA PCR产物送到北京华大基因进行测序。序列见SEQl，测得菌株N6-2的 16S rDNA序列长度为1409bp。
[0046] 将菌株N6-2的16S rDNA序列在NCBI的核酸数据库中通过化AST进行分析。通过 MEGA6软件Neighbor-joining选项绘制发育树：BLAST重复1000次，选择模型核酸P-dis化nce，得到结果如图1所示。
[0047]下载与实验菌株亲缘关系较近的序列，用BioEdit软件进行多序列对比，与菌株 N6-2的 16S rDNA序列（1409bp)相似性比较高的菌株为BacillussafensisstrainFO-036b(T)(99.72%)、Bacillus pumilus ATCC 7061(T)(99.65%)、Bacillus altiUidinis 41KF化(T)(99.29%)通过《常见细菌系统鉴定手册》，可W确定为芽抱杆菌属(Bacillus)的 细菌，且相似性最高的是沙福芽抱杆菌，可能是属于沙福芽抱杆菌的变种，是一种新的芽抱 杆菌的变种，命名为Bacillus SP.N6-2。该图也证明了Bacillus SP.N6-2的系统学地位。 [004引实施例2海洋芽抱杆菌N6-2产生的新型0-葡聚糖酶的分离纯化
[0049] (1)菌株的发酵：
[0050] 取海洋芽抱杆菌N6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在28°C的摇床中 150巧m，培养28h;将上述培养后的菌株按4%(v/v)的接种量接种于发酵培养基，28°C， 150rpm摇床培养80h;取菌株发酵液，离屯、，去掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在7.0， 即为粗制发酵样品。
[0051] (2)超滤截留：
[0052] 取海洋芽抱杆菌N6-2发酵液，在SOOOrpm下离屯、，除掉菌体与部分杂质。依次用分 子量为5040曰、3040曰、1040曰、化0曰、340曰的滤膜，截留发酵液，将发酵液分成3~化0曰、5~ 101^)曰、10~301^)曰、30~501^)曰的组分，电泳检测。
[0053] (3)硫酸锭沉淀法浓缩：
[0054] 取步骤(2)所述的10~30kDa组分，置于冰浴之中，缓慢向其中加入硫酸锭固体粉 末，使其水溶液浓度达到30%，4°C静置化，lOOOOrpm，离屯、lOmin，沉淀作为杂蛋白，遗弃，取 上清取，向其中缓慢加入硫酸锭固体粉末，使其水溶液浓度达到65 %，4°C静置2h， lOOOOrpm，离屯、IOmin，取沉淀，弃上清。沉淀用50mmol/L的pH7.96S径甲基氨基甲烧盐酸盐 (Tris-HCl)缓冲液溶解，装入3W)a透析袋，置于相同缓冲液中透析，地，化，1化换一次等浓 度缓冲液，既获得硫酸锭饱和浓度在30 % -65 %的组分。
[0055] (4)离子交换色谱法提取新型0-葡聚糖酶
[0056] 1. Q离子交换层析
[0057] 取步骤(3)所述的硫酸锭饱和浓度30%-65%的组分，过Q离子交换层析柱，上样缓 冲液为50mmol/L的抑7.96S径甲基氨基甲烧盐酸盐(化18-肥1)缓冲液，每次上样量为51111^， 洗脱液为含Imol/L化Cl的化is-HCl上样缓冲液，洗脱液W100% (v/v)的浓度进行洗脱，流 速为3mL/min，检测波长为280nm，收集各峰，将穿透Ql组分脱盐后真空冷冻干燥保存；
[0化引2. CM离子交换层析
[0059] 取收集的穿透峰Ql，过CM离子交换柱，上样缓冲液为25mmol/L的抑9.0氨氧化钢甘 氨酸缓冲液(化OH-Glycine)，每次上样量2mL，洗脱液为含Imol/L化Cl的氨氧化钢甘氨酸 上样缓冲液，洗脱液Wl〇〇%(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，收集各峰，将穿透峰Cl 组分脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽抱杆菌N6-2产生的新型0-葡聚糖酶。
[0060] 实施例3海洋芽抱杆菌N6-2产生的新型0-葡聚糖酶的纯度检测
[0061 ] 1.Protein-PAK ? 60疏水性的蛋白分析柱检测纯度
[0062] 取经CM柱收集的穿透峰Cl,过Protein-PAK ? 60疏水性蛋白分析柱，上样量为化 L，流动相为水，峰图结果显示为单一峰。
[0063] 2. SDS-PAGE电泳检测新型0-葡聚糖酶的纯度
[0064] 基于现有SDS-PAGE技术，将超滤膜截留（I号样品）、硫酸锭沉淀30%-65% (2号样 品）、CM离子交换峰Cl(3,4号样品）、Q离子交换穿透峰Ql(5号样品）进行12%的SDS-PAGE凝 胶电泳检测。红框显示就是海洋芽抱杆菌N6-2产生的新型0-葡聚糖酶。见图2。
[0065] 实施例4ESI质谱检测新型0-葡聚糖酶的分子量
[0066] 将穿透峰Cl水溶液通过Cole化rmer 74900注射累打入ESI-MS进行分析。（此实验 由中国科学院青岛生物能源与过程研究所协助完成)检测结果显示海洋芽抱杆菌N6-2产生 的新型e-葡聚糖酶的分子量是24kDa。见图3。
[0067] 实施例5海洋芽抱杆菌N6-2产生的新型0-葡聚糖酶的N端序列分析
[0068] 1.采用Edman降解法(此项实验由北京大学生命科学学院蛋白测序实验室协助完 成)测得N6-2产生的新型0-葡聚糖酶的N端15个氨基酸的序列是STGGS FYEPF NNYNT。
[00例 2.新型0-葡