聚糖酶N端序列的分析
[0070] 将本发明的海洋芽抱杆菌N6-2蛋白的N端序列分别与Bacillus altitudinis的 beta-1,3-1,4-glucanase、BaciIlus safensis的beta-glucanase、Bacillus pumilus的 beta-glucanase、BaciIlus Licheniformis beta-glucanase的N端序列作同源性比较。相 同的氨基酸在用*表示，不同的氨基酸用空格表示。氨基酸相同率皆为（14/15)93.3%，说明 海洋芽抱杆菌N6-2产生的新型0-葡聚糖酶与W上菌的be化-glucanase具有很大的同源性。 NCBI blast结果说明该0-葡聚糖酶是一种新型的0-葡聚糖酶。
[0071 ]表2.新型0-葡聚糖酶N端序列同源性比对
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[0074] 实施例6新型(6-葡聚糖酶活性测定
[0075] 1.酶活力单位定义化/mU:在40°C和抑6.0条件下，Imin从0-葡聚糖溶液中分解产 生1皿Ol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位。
[0076] 2.葡萄糖标准曲线的绘制:配制0、0.5、1、2、3、4、5、6、7111邑/1111的葡萄糖溶液，向每 只试管中加入1.5mL的葡萄糖溶液，在每支试管中加入3mL DNS试剂，于沸水中煮lOmin。每 管中加蒸馈水定容到25mL混匀，用空白管调零点，于550皿处进行比色测定，记录OD550 , W葡 萄糖(mg)为横坐标，WODsso为纵坐标绘制出标准曲线。
[0077] 3.酶活力测定体系：设置1个空白组，1个反应组，向反应组试管中加入1. SmLlOmg/ HiL的0-葡聚糖溶液，40°C水浴预热5min，加入0.2mL适当稀释后的酶液，空白组加入 1.5mL10mg/mL的0-葡聚糖溶液，40°C水浴预热5min后加入0.2mL适当稀释后灭活酶液。40°C 水浴反应15min后加入3mL DNS试剂终止反应，于沸水中煮IOmin。每管中加蒸馈水定容到 25mL混匀，W空白调零，在550nm处进行比色测定。
[007引4.实验测得该新型0-葡聚糖酶的酶活力为：13.3U/mL。
[0079] 5.该新型(6-葡聚糖酶具有较高的酶活力，在酿酒工业，工业废水处理，功能性食品 的开发及饲料应用方面具有广阔的开发潜力和应用前景。
【主权项】
1. 一种新型β-葡聚糖酶，其特征在于所述新型β-葡聚糖酶由海洋芽孢杆菌N6-2产生， 分子量为24kDa，所述新型β-葡聚糖酶Ν端由15个氨基酸组成，其氨基酸序列为STGGS FYEPF ΝΝΥΝΤ，所述的海洋芽孢杆菌Ν6-2于2014年11月23日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心， 保藏号为CCTCC Ν0:Μ2014586。2. 权利要求1所述新型β_葡聚糖酶的制备方法，其特征在于它的步骤:将海洋芽孢杆菌 Ν6-2菌株接种于含有种子培养基的试管中，在15-36°C的摇床中100_300rpm，培养25-30h; 将上述培养后的菌株按2-6% (v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，15-36°C， 100-300rpm，发酵培养48-90h;取菌株发酵液，离心，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其 pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品；超滤法粗提，获得10~30kDa组分，用硫酸铵沉淀法获得 硫酸铵饱和浓度在30 %-65 % (g/ml)的组分，将30 % -65 % (g/ml)的组分过Q离子交换层析 柱，将穿透峰Q1脱盐后真空冷冻干燥保存，将收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，收集穿透 峰C1，脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2所产生的新型β-葡聚糖酶。3. 根据权利要求2所述的新型β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于所述的种子培养基 的成分及质量体积比：牛肉膏〇. 2-0.8%、蛋白胨1 -2%、氯化钠0.3-1 %，ρΗ6.8-7.5。4. 根据权利要求2所述的新型β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基 的成分及终浓度:蔗糖〇 . 5-1 % (质量体积比）、牛肉膏0.2-0.8 % (质量体积比）、蛋白胨1-2 % (质量体积比）、氯化钠0.3-1 % (质量体积比），矿物油0.5-1%。(v/v)，ρΗ6.8-7.5。5. 权利要求2所述的一种新型β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于它的具体步骤为： (1) 菌株的发酵： 取海洋芽孢杆菌Ν6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在15-36°C的摇床中100-300rpm，培养25-30h; 将上述培养后的菌株按4%(v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，15-36°C， 100-300rpm，发酵培养48-90h;取菌株发酵液，离心，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其 pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品； (2) 超滤截留 取海洋芽孢杆菌N6-2发酵液，在SOOOrpm下离心，除掉菌体与部分杂质，依次用分子量 为50kDa、30kDa、10kDa、5kDa、3kDa的滤膜，截留发酵液，获得10~30kDa的组分，调节pH值至 7.0； 所述的种子培养基的成分及终浓度:牛肉膏0.2-0.8% (质量体积比），蛋白胨1-2% (质 量体积比），氯化钠0.3-1 % (质量体积比），pH6.8-7.5; 所述的发酵培养基的成分及终浓度:蔗糖〇.5-1% (质量体积比），牛肉膏0.2-0.8% (质 量体积比），蛋白胨1-2 % (质量体积比），氯化钠0.3-1 % (质量体积比），矿物油0.5-1%。( v/ ν)，ρΗ6·8-7·5; (3) 硫酸铵沉淀法粗提 取步骤(2)所述的10~30kDa组分，置于冰浴之中，缓慢向其中加入硫酸铵固体粉末，使 其水溶液浓度达到30 % (g/ml)，4 °C静置2h，lOOOOrpm离心，沉淀作为杂蛋白，遗弃;取上清 取，向其中缓慢加入硫酸铵固体粉末，使其水溶液浓度达到65 % (g/ml)，4 °C静置2h， lOOOOrpm，离心，弃上清，取沉淀;沉淀用50mmol/L的pH7.96三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲 液溶解，装入3kDa透析袋，置于相同缓冲液中透析，4h、8h、12h换一次缓冲液，既得到硫酸铵 饱和浓度在30 % -65 % (g/ml)的组分； (4) Q离子交换层析 取步骤(3)所述的硫酸铵饱和浓度30%-65%(g/ml)的组分，过Q离子交换层析柱，上样 缓冲液为20-60mmol/L的pH6.0-8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，每次上样量为5-20mL，洗脱液为含lmol/L NaCl的上样Tris-HCl缓冲液，洗脱液以100% (v/v)的浓度进行洗 脱，流速为3mL/min，检测波长为280nm，收集穿透峰Q1，脱盐后真空冷冻干燥保存； 上述步骤中的上样缓冲液为50mmol/L，pH7.96; 上述步骤中每次上样量为5mL; (5) CM离子交换层析 取步骤(4)中收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，上样缓冲液为20-60mmol/L的pH6.0-9.0氢氧化钠甘氨酸缓冲液，每次上样量为1-lOmL洗脱液为含lmol/L NaCl的氢氧化钠甘氨 酸上样缓冲液，洗脱液以1〇〇 % (v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，收集穿透峰C1，脱盐 后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2所产生的新型β-葡聚糖酶； 上述步骤中的上样缓冲液为25mmol/L，ρΗ9.0; 上述步骤中每次上样量为2mL。6. 权利要求1所述新型β_葡聚糖酶在工业中的应用。7. 权利要求1所述新型β_葡聚糖酶在酿酒工业，工业废水处理中的应用。8. 权利要求1所述新型β_葡聚糖酶在食品行业中的应用。9. 权利要求1所述新型β_葡聚糖酶在制备魔芋饮品中的应用。10. 权利要求1所述新型β-葡聚糖酶在饲料加工中的应用。
【专利摘要】一种新型β-葡聚糖酶及其制备方法，属于海洋微生物和酶制剂领域，所述新型β-葡聚糖酶由海洋芽孢杆菌N6-2产生，分子量为24kDa，所述新型β-葡聚糖酶N端由15个氨基酸组成，其氨基酸序列为STGGS FYEPF NNYNT。所述酶能够在工业、食品行业及饲料制备行业中进行应用。CCTCC NO: M201458620141123
【IPC分类】C12N9/24
【公开号】CN105695434
【申请号】CN201610280340
【发明人】郑兰红, 康道乐, 杨康利, 梁方方, 朱美虹
【申请人】中国水产科学研究院黄海水产研究所
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年4月28日