物的细胞毒性并且将其与多种处于高 于和低于临界胶束浓度(CMC)的浓度的其他表面活性剂进行比较。作为用于细胞毒性的参 数，细胞代谢是通过XTT转化评估的。XTT检定是基于细胞的线粒体活性并且反映活性如何 和由此细胞活力如何W'25^dXTT化合物（3'[1-苯基-氨基幾基]-3,4-四挫双[4-甲氧基-6-硝基]苯横酸钢水合物)是通过线粒体减少的并且形成一种澄色甲臘染料。从黄色至澄色的 颜色改变是通过分光光度计在450nm处测量的。
[0110] 在添加表面活性剂之前，将W在用于XTT检定的线性区域内的细胞浓度接种在96 孔板内的纤维原细胞在含有10 %胎牛血清(FBS)的20化1杜尔贝科的改良伊格尔斯培养基 (Du化ecco'S modified Eagles'S medium) (DMEM)中培养24小时。然后将该培养基移除并 且将20化1的相应的表面活性剂溶液加入到运些孔中并且解化1小时。将该表面活性剂溶液 移除并且将20化1的XlT介质加入到运些孔中，包括空白物，并且解化2小时（37°C，5%C02)。 吸光度是在450nm下测量的。结果表示为作为对照培养物（未处理的细胞）的％的观察到的 吸光度。如在图15a中可W看出，细胞活力在CisGsm的组合物(在图中表示为C16G8)中比在 聚山梨醇醋80和C16G2两者中更高。对于CisGsm组合物细胞活力在其下降低了50%的浓度 (I巧0)为0.43mM，与对于聚山梨醇醋80的0.13mM和对于C16G2的0.017mM相比。
[0111] 在表面活性剂组合物被移除后，已经暴露于C16G8/14混合物的细胞在2小时之后完 全复原（图15b)，而对于聚山梨醇醋80观察到稍微较不完全的复原。另一方面，已经暴露于 C16G2的细胞在2小时的过程中完全没有复原。
[01。]化学稳定性
[0113] 将C16G8/14混合物在对于氧化敏感的水性制剂中的化学稳定性与两种不同等级的 聚山梨醇醋80(超级精制的和制药等级）的化学稳定性进行比较。下径甲苯(BHT)被用作易 氧化模型化合物。BHT容易地被氧化为3,3'，5,5'-四-双-(叔下基)-巧酿，其是亮黄色。将 0.5mg/ml的微粉化的BHT分散在150mM化Cl溶液中，使用0.2mg/ml的表面活性剂作为分散 剂。将运些制品稳定地置于室溫和4(TC下。将运些制剂通过HPLC分析并且在固定的时间点 进行目视检查。在该研究过程期间，瓶子的目视检查掲示了对于含有聚山梨醇醋的溶液逐 渐的黄色变色是更加显著的，运清楚地指示了相比该C16G8/14混合物的聚山梨醇醋的更低的 化学稳定性。HPLC结果提供了运个结论的定量符合(quantitative conformation)，如在图 4中显示的。如明显的，就制剂的化学稳定性而言，C16G8/14混合物是大大优于运两个等级的 聚山梨醇醋。在实际情况中，在28周研究的过程中，在该CisGsm混合物体系中的BHT含量没 有减少，即使在加速条件下(40°C)。另一方面，在聚山梨醇醋体系中，发现BHT含量随时间的 推移显著减少。
[0114] 肤和蛋白质聚集的抑制
[0115] 肤和蛋白质聚集的抑制对物理稳定性和安全性是关键性的，特别对于用于注射的 药物(注射剂）。因此，在此类制剂中表面活性剂通常是作为肤和蛋白质聚集的抑制剂应用。 使用膜岛素作为模型肤调查C16G8/14混合物抑制溶液中的肤和蛋白质聚集的能力。在该研究 中，将C16G8/14混合物与W下项进行比较:聚山梨醇醋20(-种目前批准用于注射剂的标准表 面活性剂）、和Ci4G2(十四烷基麦芽糖巧；一种新颖的赋形剂，购自Anatrace(昂飞公司 (Affymetrix)),最近由埃癸斯治疗公司建议用于此应用，参见在该研究中，膜岛素 浓度是0.4mg/ml并且表面活性剂浓度是1.4mg/ml。溶液的抑是通过巧樣酸盐缓冲在或者抑 6.8(加速条件)或抑7.4。将溶液分S份稳定地放在25°C和40°C下，并在2、4、8和12周后通 过目视检查分析。该研究的结果汇总在表2中。如明显的，证明Ci4&不能抑制沉淀，即使在非 加速条件下。聚山梨醇醋20表现相当地更好，但是在40°C下在或者pH 6.8或抑7.4下并不 阻止沉淀。在该研究中的=种表面活性剂中，证明C16G8/14混合物是优越的。对于此表面活性 剂组合物，仅对于最加速条件(4(rC，pH6.8)观察到沉淀。
[0116] 表2.来自调查聚山梨醇醋20X14G2和C16G8/14混合物抑制膜岛素沉淀的能力的研 究的结果。填充的格表示其中在指示的条件下储存给定时间后观察到固体沉淀物的体系。
[0117]
[0"引悬浮液(分散体;溶胶)的制备
[0119] 所选择的表面活性剂组合物充当用于微粉化的、疏水性颗粒的有效分散剂的倾向 是在使用两种类固醇药物布地奈德和二丙酸倍氯米松（bee Iometasonedipropionate) (BDP)作为模型化合物的药物制剂中测试的。W下新颖的烷基糖巧组合物包括在运些研究 中：扣268/14、(：1668/14、^及(：16-1864-20。将运些组合物与常规的烷基糖巧组合物1660 0曰'6 CG90(主要由Cis-isGi组成）、Ci6-isGi-3、W及CisGs进行比较。
[0120] 此外，将运些新颖的组合物的性能与乙氧基化的表面活性剂聚山梨醇醋SO(PSSO) 的性能进行比较。在该研究中使用的PS80具有超级精制等级，其代表当前技术的技术发展 水平。
[0121] 测试悬浮液是如下制备的：将适当的表面活性剂溶解在水中至20mg/ml的浓度。将 一定量的药物粉末添加至含有该表面活性剂溶液的烧杯中，使得标称药物浓度是50mg/ml。 然后使用或者（1)通过Ul化a化rrax混合装置的高剪切混合，或者(2)使用磁力揽拌棒的低 剪切混合将该药物分散在该表面活性剂溶液中。使用运些混合装置中的任一种揽拌1分钟 后，将所得到的悬浮液转移至容量瓶中并且通过添加0.15M化Cl稀释100倍。因此，最终的 药物浓度是0.5mg/ml，并且最终的表面活性剂浓度是0.2mg/ml。
[01剖不论混合模式含有CuGsm和Ci6(i2的两种抓P悬浮液是宏观上不均匀的，并且含有 通过肉眼清楚地可见的大聚集体。如此证明的目视检查足W示出运些表面活性剂组合物对 于预期目的是无用的，并且运些悬浮液不经受进一步的表征。另一方面，发现含有C16G8/14和 PS80的BDP悬浮液对于肉眼是均匀的，并且因此经受通过激光衍射（马尔文粒度分析仪 (Malvern MasterSizer))和快速颗粒图像分析（马尔文FPIA3000)的进一步的、详细的分 析。如从图4中显示的激光衍射数据明显的，在高剪切条件下使用PS80作为分散剂导致斜对 称的颗粒尺寸分布，清楚地指示聚集。另一方面，使用C16G8/14混合物，产生了几乎完全的对 称分布而没有聚集的迹象。图5示出了通过低剪切混合制备的体系的对应的数据。由于低剪 切，发现聚集体在此实验中是大量的。然而，C16G8/14与PS80之间仍然存在巨大的差异。在前 者的情况下，聚集体的存在是明显的如衍射数据的大尺寸尾部的波动。然而，运些波动的小 尺寸强烈地表明聚集体的量是非常低的。另一方面，在PS80的情况下，尺寸分布函数显示了 显著的双峰性，清楚地表明了更加广泛的聚集。源自运些激光衍射数据的结论通过来自图 像分析的数据证实和延伸。运些数据（W聚集体和初级颗粒的显微照片的形成，图6-9)显示 了用C16G8/14混合物代替PS80允许用低剪切混合代替高剪切混合，而不牺牲适当的分散。运 代表在过程设定中的巨大优势，因为高剪切混合导致大量的发泡，和与产率和再现性有关 的伴随问题。已经选择了在图6-9中显示的图像使得它们代表了一个群体，该群体是运些体 系中的最大物体(聚集体/颗粒）的统计学上的代表。重要的是认识到在运两种情况下聚集 体是非常不同的:在PS80的情况下，聚集体是松散结合的初级颗粒的分形物体，而在C16G8/14 混合物的情况下它们实际上由融合在一起的初级颗粒构成。前者类型的聚集体可能用一种 足够活性的分散剂分散，而后者不能(它们起源于API生产中的结晶步骤并且因此存在于在 悬浮液的制备中所使用的起始材料中）。因此，图6-9中的图像提供了另一个证据:Ci6Gs/i4是 一种比PS80更有效的润湿剂(分散剂）。
[0123] 多分散烷基糖巧组合物(C16-18G4-20)充当有效的分散剂的能力通过相同的实验方 案调查，但微粉化的布地奈德作为模型药物。此外，悬浮液通过激光衍射来表征。
[0124] 图 10、11 和 12分别示出了对于含有Ci6-18G4-20、Ci6-18Gi-3和TEGO Care CG90(主要由 Ci6-18Gi组成)作为分散剂的布地奈德悬浮液的激光衍射数据。如在图10中可W看出，当使用 C16-18G4-20作为分散剂时获得的颗粒尺寸分布是完全对称的且单峰的。运清楚地表明该体系 包括仅适当分散的初级颗粒，并且因此证明C16-18G4-20的优异的润湿特性。在鲜明对比下，当 使用Ci6-18Gi-3作为分散剂时获得的分布（图11)是显著双峰的，表明差的润湿W及相当大的 聚集。对于TEGO Care CG90,该情况甚至更差，如图12中所示。在此，仅聚集体，并且没有初 级颗粒，在衍射数据中是明显的。总之，运些结果清楚地说明头基长度对表面活性剂性能的 重要性，并且还示出了具有多于=个重复葡萄糖单元的烷基糖巧的优越性。
[01巧]悬浮液的热稳定性
[0126] 用根据本发明的表面活性剂组合物制备的悬浮液的热稳定性通过将微粉化的布 地奈德的悬浮液(0.5mg/ml)在水浴中加热到90°C持续30分钟并且在高压蓋中加热至125 °C 持续8分钟来调查。运些悬浮液是如前所述、使用0.2mg/ml的C16G8/14混合物作为分散剂通过 高剪切混合制备的。颗粒尺寸分布是通过激光衍射测量调查。为了比较，还使用聚山梨醇醋 80作为分散剂制备了微粉化的布地奈德的悬浮液。
[0127] 关于使用聚山梨醇醋80作为分散剂制备的悬浮液的颗粒尺寸分布的数据在图13 中示出。如明显的，将悬浮液加热到90°C引起颗粒尺寸分布朝向更高的颗粒尺寸的实质性 的偏移。运些数据证明加热降低了聚山梨醇醋充当分散剂的能力并且因此引起初级颗粒的 聚集。运个观察与基于PEG的表面活性剂在升高的溫度下相分离的一般倾向完全一