一种水溶性亚硫酸氢根比率荧光探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种亚硫酸氢根荧光探针，尤其涉及一种水溶性亚硫酸氢根比率荧光 探针及其应用；属于有机小分子荧光探针领域。
【背景技术】
[0002] 香豆素荧光团本身具有较大的摩尔消光系数和量子产率，经过修饰后可达到近红 外发光，可用于发光材料、化学传感器以及标记生物分子。近几年利用比率荧光效应检测亚 硫酸氢根，并在活体细胞中成像的研宄得到不断发展。
[0003] 亚硫酸盐是在世界范围内广泛使用的食品添加剂，可以用作食品防腐剂和漂白 剂，是十分有效的抗菌剂。人体自身在代谢过程中也会产生亚硫酸离子，但是高浓度的亚 硫酸盐能引起人腹泻、过敏、血压降低、哮喘等，WHO规定每人每日亚硫酸盐的允许摄入量为 0-0. 7mg/kg (以二氧化硫计）。现在工业生产中释放出大量的二氧化硫，形成的酸雨严重腐 蚀建筑物和庄稼，并且会导致河流湖泊过度酸化。因此在生物和实际样品中方便快捷检测 亚硫酸盐需要科学研宄者的继续努力。
[0004] 目前已经存在的亚硫酸盐的检测方法有色谱法、传感器法、电化学法、毛细管电泳 和酶技术联用等，但这些方法具有很大局限性，如仪器昂贵、处理复杂、费时等，不利于检 测。已申请的专利中【CN102072901B】、【CN103743726A】可以不使用大型仪器检测食品中的 亚硫酸盐，但是只能用于液体样的检测。而新兴的荧光法具有操作方便，灵敏度高等特点。 已授权的专利【CN102924530B】、【CN102659677B】展示了特异性检测亚硫酸盐的探针，但是 分别存在着单信号检测和无法细胞成像的缺点。基于此，开发具有细胞成像能力，而且可以 比率检测、裸眼识别的亚硫酸氢根荧光探针成为目前亟待解决的课题。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种水溶性亚硫酸氢根比率荧 光探针及其应用。
[0006] 本发明所述的水溶性亚硫酸氢根比率荧光探针，其特征在于：所述荧光探针是含 α，β -不饱和酮的3-((3'_苯并咪唑）_羰基丙烯）-7_二乙胺基香豆素，其化学结构式如 式⑴所示，
[0007]
[0008] 上述的水溶性亚硫酸氢根比率荧光探针的制备方法是：由已知方法合成3-醛 基-7-二乙胺基香豆素和5-乙酰基苯并咪唑，然后二者反应得到3-((3' -苯并咪唑）_羰 基丙烯）-7-二乙胺基香豆素，单晶结构如图1。
[0009] 上述的水溶性亚硫酸氢根比率荧光探针在检测含亚硫酸氢根样品中的应用。
[0010] 上述应用中：所述含亚硫酸氢根样品优选是生物细胞、含亚硫酸氢根的食品或含 亚硫酸氢根的溶液。
[0011] 本发明所述的水溶性亚硫酸氢根比率荧光探针在制备亚硫酸氢根裸眼检测试纸 中的应用。
[0012] 本发明所述的探针3-((3'-苯并咪唑）-羰基丙烯）-7-二乙胺基香豆素可以与亚 硫酸氢根在水溶液中发生迈克加成反应，阻断共轭体系，如图2所示，释放出香豆素蓝色荧 光，从而达到检测的效果。
[0013] 具体的：配制3-((3' -苯并咪唑）-羰基丙烯）-7-二乙胺基香豆素的PBS缓冲 液（CTAB ImM，pH = 7. 4)的溶液，分别定量加入微升级的Cys，GSH，巯基乙醇，2-氨基吡 啶，HSO3' CH3CO2' ClO3' CN' CO32' H2PO4' HCO32' HPO42' Γ，Cl' Γ，IO3' NO2' NO3' S2' S 2032_，SO广，SO,的水溶液。通过紫外可见分光光度法和荧光分光光度法测试其对不同硫醇、 常见阴离子的选择性和响应能力。结果显示探针3-((3'-苯并咪唑）-羰基丙烯）-7-二乙 胺基香豆素对亚硫酸氢根有很好的选择性，加入亚硫酸氢根前后对照显示荧光发射波长发 生了 147nm的蓝移，具有非常好的比率响应。见图3,4。
[0014] 在加入I. 0 μ M的3- ((3' -苯并咪唑）-羰基丙烯）-7-二乙胺基香豆素的A549 活细胞中不加入NaHSO3和加入NaHSO 3对照细胞染色荧光显微成像变化。荧光成像显示 3_ ((3' -苯并咪唑）-羰基丙烯）-7-二乙胺基香豆素渗透进细胞内。对照组A细胞蓝色通 道无荧光，红色通道亮色荧光。对照组B蓝色通道显荧光，红色通道荧光淬灭。见图5。
[0015] 在不同浓度NaHSO3水溶液中加入0.01mg/mL的3-((3' -苯并咪唑）-羰基丙 烯）-7-二乙胺基香豆素滤纸，观察可见光和紫外灯下荧光变化。结果显示随亚硫酸氢钠浓 度增大，可见光下试纸由淡红色变为淡蓝色，紫外灯下试纸由红色变为蓝色。见图6。
[0016] 本发明提供的水溶性亚硫酸氢根比率荧光探针3-((3' -苯并咪唑）-羰基丙 烯）-7-二乙胺基香豆素可以选择性地与亚硫酸氢根作用，由红色变为淡蓝色，可肉眼分 辨，具有荧光比率响应效应，也可以通过紫外吸收和荧光光度法进行分析。不仅可以比率检 测亚硫酸氢根离子，实现细胞内的比率成像，而且做成的试纸条可以迅速裸眼检测液体样 中亚硫酸氢根含量。有望在工业生产和食品检测及生物科学中发挥作用，具有广阔的应用 前景。
【附图说明】
[0017] 图1为3-((3' -苯并咪唑）_羰基丙烯）-7_二乙胺基香豆素单晶结构示意图。
[0018] 图2为3- ((3 ' -苯并咪唑）-羰基丙烯）-7-二乙胺基香豆素与亚硫酸氢钠加成产 物的高分辨质谱。
[0019] 图3为3-((3'-苯并咪唑）-羰基丙烯）-7-二乙胺基香豆素的PBS缓冲液（CTAB ImM，pH = 7. 4)的溶液加入常见阴离子和多种硫醇的紫外吸收图谱。
[0020] 图4为3-((3'_苯并咪唑）-羰基丙烯）-7-二乙胺基香豆素的PBS缓冲液（CTAB ImM，pH = 7. 4)的溶液加入常见阴离子和多种硫醇的荧光发射图谱。
[0021] 图5为3- ((3 ' -苯并咪唑）-羰基丙烯）-7-二乙胺基香豆素在A549细胞内荧光 显微成像图。
[0022] 其中：A组是在37°C条件下，A549细胞在加入Ι.ΟμΜ的3_((3' -苯并咪唑）-羰 基丙烯）-7_二乙胺基香豆素的细胞培养液中培养1小时；B组为Α549细胞在加入I. 0 μΜ 的2-(3-乙酰基）香豆素基丙烯酸酯的细胞培养液中培养1小时，PBS缓冲溶液洗涤三次 后，然后再在含有5mM NaHSO3的细胞培养液中浸泡0. 5小时的图像。
[0023] 图6为3- ((3'_苯并咪唑）-羰基丙烯）-7-二乙胺基香豆素作为检测亚硫酸氢根 的试纸在可见光及紫外灯下获得的照片。
[0024] 其中：用0.01mg/mL的3-((3'-苯并咪唑）-羰基丙烯）-7_二乙胺基香豆素溶液 浸泡滤纸，烘干制成试纸