一类用于监测不同亚细胞器中脂质过氧化进程的荧光探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一类用于监测不同亚细胞器中脂质过氧化进程的巧光探针，其属于精 细化工技术领域。
【背景技术】
[0002] 脂质过氧化化ipidperoxidation,LP0)被明确报道是众多疾病的主要发病机制， 如癌症，动脉粥样硬化，神经系统疾病，等等。LP0的本质是基于不饱和脂肪酸的一类自由基 的连锁反应，其通常是由活性氧自由基（reactive0巧genspecies,R0巧引发，而其对机体 的致病性损伤往往超出R0S对细胞内膜结构的氧化破坏。LP0给机体带来的恶性的结果源 于连锁反应的持续进行，连锁反应会不断释放活性物质，如丙二醒，此类物质会引发多种破 坏性反应，损伤机体活性。因此，研究生物体内的LP0进程对于特定疾病的预防或者前期治 疗具有重要意义。
[0003] 巧光显微技术作为一种直观实时的监测手段适合于对活细胞进行无损的动态监 巧。。尽管已有部分报道利用巧光成像手段监测LP0的发生，然而已报道的具有亚细胞器祀 向性的LP0探针却很少，主要是基于商品化LP0探针CII-BODIPYSwsm，而且其合成制备工艺 比较繁琐，致使其成本较高，价格昂贵，不利于广泛使用，仅有一例祀向线粒体的LP0探针 MitoPer化也是基于CII-BODIPYSwsm进行的结构衍生，合成复杂。对于更多其它亚细胞器 祀向性的LP0探针尚无报道。依据研究相关病症的需求，我们致力于设计具有不同亚细胞 器祀向性的LP0探针，为LP0相关疾病的诊断与治疗提供更微观的信息和研究工具。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一系列用于祀向不同亚细胞器并能检测 其中脂质过氧化进程的巧光探针及其制备方法，系列巧光探针制备成本低、专一性祀向不 同亚细胞器、对脂质过氧化过程敏感并可通过巧光比率成像相对定量的监测脂质过氧化进 程。
[0005] 本发明采用的技术方案是：用于祀向不同亚细胞器并能检测其中脂质过氧化进程 的巧光探针，W氣棚化咯为母体，具有如下结构通式：
通式中Ri、R2 =H、Ci-Ci追链或支链烷基；R3 =H或
，其中取=
[0006] -类用于监测不同亚细胞器中脂质过氧化进程的巧光探针的制备方法，所述Rs= H的巧光探针制备方法为：
摩尔的氣棚二化咯衍生物与1摩尔的肉桂醒为原料，W赃晚为催化剂，4A分子筛为 脱水剂，所述氣棚二化咯衍生物与催化剂的摩尔比为1:0. 01，在甲苯中130°C，在氣气或氮 气气体的保护下揽拌，反应8-2地，肉桂醒与氣棚二化咯的活泼亚甲基脱水生成含有共辆双 键的巧光探针。
[0007] -类用于监测不同亚细胞器中脂质过氧化进程的巧光探针的制备方法，所述R3 = 的巧光探针制备方法包括W下步骤： (1)氣棚二化咯衍生物M的制备
W1摩尔的含有3-氯丙基的氣棚二化咯衍生物与1摩尔的肉桂醒为原料，W赃晚为催 化剂，4A分子筛为脱水剂，所述氣棚二化咯衍生物与催化剂的摩尔比为1:0. 01，在甲苯中 130°C，在氣气或氮气气体的保护下揽拌，反应8-2地，肉桂醒与氣棚二化咯的活泼亚甲基脱 水生成含有共辆双键的氣棚二化咯衍生物M; (2)探针分子通过W下两种路线得到： 路线一
将氣棚二化咯衍生物M与相应肿胺溶于丙酬、氯仿或DMSO等溶剂中，加入与中间体M摩尔比为1:1的碳酸钟和舰化钟在30-130°C下反应3-lOh，得到巧光探针分子；所述仲胺选 自二甲胺、吗嘟、甲基赃嗦或苄基赃嗦； 路线二
将氣棚二化咯衍生物M与相应叔胺或S苯基麟衍生物溶于丙酬、氯仿或DMSO等溶剂 中，加入与中间体M摩尔比为1:1的舰化钟在30-130°C下反应3-2地，得到探针分子，所述 巧光探针与含有不同阴离子的钢盐或钟盐在甲醇中揽拌2地，使进行离子交换，得到含有不 同反离子的巧光探针；所述叔胺选自=甲胺、二甲基苄基胺或二甲氨基丙醒，所述=苯基麟 衍生物选自=苯基麟或醒基=苯基麟。
[0008] 所述巧光探针分别祀向定位于不同的亚细胞器中并通过巧光光谱的变化指示亚 细胞器的脂质过氧化进程。所述巧光探针用于活细胞中不同亚细胞器的祀向定位及其内部 脂质过氧化进程的检测。可W被标记的活细胞为化11a细胞株、MCF-7细胞株、RAW264. 7细 胞株、7702细胞株等。
[0009] 本发明的有益效果是：一系列用于祀向不同亚细胞器并能检测其中脂质过氧化进 程的巧光探针W氣棚化咯为底物与肉桂醒在氮气或氣气保护下反应，W赃晚为催化剂、4A 分子筛为脱水剂；所得反应物再与肿胺、叔胺或=苯基麟反应得到巧光探针分子。系列探 针分子在590nm的长波区发射巧光，对活性氧自由基敏感，即参与活细胞内的脂质过氧化 过程后，共辆双键被破坏，其发射波长变为520nm左右的短波长，通过短波长（约520nm)与 长波长(约590nm)两处的巧光发射强度的比值变化，可W检测活细胞内的脂质过氧化程度。 同时，不同探针由于含有不同活性基团（即R4)，其具有不同的亚细胞器祀向性，即系列探针 可分别检测活细胞中不同亚细胞器(线粒体、溶酶体或细胞膜）内的脂质过氧化过程。该探 针本身性质稳定，易于长期保存，对脂质过氧化过程有灵敏的响应，并可通过巧光比率成像 指示脂质过氧化的程度，为探究活细胞内微观结构中的脂质过氧化相关过程提供了直观的 检测试剂。
【附图说明】
[0010] 图1是巧光探针A在邸2化溶液中参与脂质过氧化过程后的光谱变化。
[0011] 图2是巧光探针A对MCF-7细胞中的脂滴染色后的巧光成像。
[0012] 图3是巧光探针A对MCF-7细胞中脂滴内的脂质过氧化过程进行巧光成像检测。
[0013] 图4是巧光探针B-1在溶液中参与脂质过氧化过程后的光谱变化。
[0014] 图5是巧光探针B-1对RAW264. 7细胞中溶酶体染色后的巧光成像。
[0015] 图6是巧光探针B-1对RAW264. 7细胞中溶酶体内脂质过氧化过程进行的巧光成 像检测。
[0016] 图7是巧光探针C-1对MCF-7细胞中线粒体染色后的巧光成像。
[0017] 图8是巧光探针C-1对MCF-7细胞中线粒体内脂质过氧化过程进行的巧光成像检 测。
[0018] 图9是巧光探针C-2对化11a细胞中细胞膜染色后的巧光成像。
[0019] 图10是巧光探针C-2对化11a细胞中细胞膜上脂质过氧化过程进行的巧光成像 检测。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1
在两口反应瓶中加入四甲基氣棚化咯500mg、肉桂醒129mU再加入500mL的赃晚为催 化剂，4A分子筛为脱水剂，在甲苯中120°C揽拌反应化，反应物减压旋干，除去甲苯后，硅胶 柱分离(洗脱液为二氯甲烧：正己烧=1:4)得到紫色固体155mg，产率23%。
[0021] 实施例2
在两口反应瓶中加入四甲基氣棚化咯500mg、肉桂醒94mU再加入500mL的赃晚为催化 剂，4A分子筛为脱水剂，在甲苯中120°C揽拌反应化，反应物减压旋干，除去甲苯后，硅胶柱 分离(洗脱液为二氯甲烧：正己烧=1:4)得到紫色固体194mg，产率31%。
[002引将上步中得到产品lOOmg溶于DMSO中，加入过量吗嘟100血，24mgK2CO3和30mg KI，60°C反应12h，反应物水洗并由CH2CI2萃取，保留有机相，无水硫酸儀干燥后，减压旋干， 硅胶柱分离(洗脱液为二氯甲烧：甲醇=20:1)得到紫色固体81mg，产率75%。
[002引实施例3
在两口反应瓶中加入四甲基氣棚化咯500mg、肉桂醒88mU再加入500mL的赃晚为催化 剂，4A分子筛为脱水剂，在甲苯中120°C揽拌反应化，反应物减压旋干，除去甲苯后，硅胶柱 分离(洗脱液为二氯甲烧：正己烧=1:4)得到紫色固体217mg，产率35%。
[0024]将上步中得到产品lOOmg溶于丙酬中，加入过量叔胺50mg，KI30mg，60°C反应12h，浓缩反应液，并加入乙酸，有深紫色固体析出，即为目标产品。将巧光探针溶于甲醇中， 加入lOOOmg的高舰酸钟，50°C揽拌24h后将反应液减压旋干，溶于少量二氯甲烧，过滤除去 无机盐，保留滤液，再次减压旋干，得到141mg深紫色固体，即为反离子是高舰酸根的巧光 换针，两步总广率88%。
[00幼 实施例4
在两口反应瓶中加入四甲