专利名称：一种高温脂肪酶、其编码基因序列及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说，涉及一种编码嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4脂肪酶的DNA序列，还涉及含有该酶基因的重组质粒和表达相应酶的重组菌株。
背景技术：
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一种特殊的水解酶，其分解脂肪，催化分解三酸甘油酯，产生甘油酯，游离脂肪酸和甘油。脂肪酶是水溶性的，其催化反应的特征是能在不溶性底物和水相界面上迅速催化分解酯键，而对水溶性底物作用很小。这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性，例如通常用化学催化剂金属钠或烷基醇钠来加快酰基在甘油酯分子间的迁移，但并无位置特异性，如用1，-3，-专一性脂肪酶催化时，酰基迁移限制在1，-3，-位上，可以生成化学法不能生产的特殊的甘油三酸酯混合物[Matsuo英国专利应用(British Patent Application)，2335-350，1980]。由于具有不需要辅酶就能催化正逆反应的优点，近些年来，脂肪酶作为类脂化合物合成分解和酯交换的催化剂，已广泛应用于油脂水解、食品风味和香味的改进、皮革绢纺脱脂、低等油脂的改性及添加于洗涤剂中以提高去污能力等[陈清馥，生物技术，242-44，1992；Arnold等，乳品科学杂志(Jour of Dairy Science)581127，1975；Carasik德国专利German patent2109-119，1970；Andree等，应用生物化学杂志(J Appl Biochemistry)2218-229，1980；Suzuki，美国专利US Patent 6,306,813，2001年10月23日]。
脂肪酶的研究始于胰脂酶，但由于其来源有限，故微生物脂肪酶的研究越来越受到重视。脂肪酶已从多种不同的微生物中分离，如青霉(黄建忠等，工业微生物，25(3)1-5，1995)、白地霉(谢舜珍等，微生物学报，26(3)260-264，1986)、根霉菌(金其荣等，工业微生物，25(1)17-20，1995)、类产碱假单胞菌(吴松钢等，微生物学报，37(1)32-39，1997)、假单胞菌(Kotsuka等，美国专利US Patent 5,846,801，1998年12月8日)、假丝酵母等[William等，微生物酶和生物技术(MicrobialEnzymes and Biotechnology)，应用科学出版社出版(Applied SciencePublishers Ltd)，1983，225～247]，其中多数脂肪酶的最适作用温度较低(35～40℃左右)，热稳定性较差，当作用底物为高凝固点油脂，如氢化油、牛油、乌桕脂、棕榈油等，此类酶就不太适合，需要具有热稳定性的脂肪酶，以适应工业要求。
已有一些来自细菌的脂肪酶具有一定的热稳定性，如嗜热芽孢菌Bacillus stearothermophilus产生的脂肪酶最适温度为55℃[Sinchaikul等，蛋白质纯化实验(Protein Expr Purif)，22(3)388-98，2001]；假单胞菌Pseudomonas sp.产生的脂肪酶最适温度为55-65℃(石田礼子等，中国专利CN1129954A；1996年8月28日)；假单胞菌Pseudomonas fragi产生的脂肪酶最适温度为55-65℃(SHIGEYUKI等，日本专利JP2039890，1990年2月8日)；Aspergillus niger产生的脂肪酶最适温度为55℃[Namboodiri等，脂质(Lipids)，35(5)495-502，2000]；Pseudomonas cepacia产生的脂肪酶最适温度为55-60℃[Sugihara等，生物化学杂志(J Biochem)(Tokyo)112(5)598-603]。微生物产生脂肪酶种类多，不同来源的脂肪酶具有多方面不同性质，从而导致各具特色的应用范围。因而需要持续不断地开发新特性脂肪酶以更好地满足工业需要。
关于脂肪酶基因已有专利和文献报道。如Rey等报道了Fusariumvenenatum的脂肪酶基因(美国专利US Patent 6,432,898，2002年8月13日)；Lin等报道了Pseudomonas pseudoalcaligenes的脂肪酶基因(美国专利USPatent 5,766,913，1998年6月16日)；CLAUDIA等报道了Candida rugosa的脂肪酶基因(欧洲专利WO9914338，1999年3月25日)；HARUMI等报道了Pseudomonas sp.的脂肪酶基因(欧洲专利，EP0812910，1997年12月17日)；YUJI等报道了Geotrichum candidum的脂肪酶基因(日本专利，JP2174680，1990年6月6日)。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型脂肪酶、及其结构基因、重组质粒和重组菌体，该基因表达产物脂肪酶在高温条件下显示活性，可应用于洗涤剂工业和其他工业过程。同时本发明提供了一种方法，即通过分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到其它受体菌，由其它菌株或在其它培养条件产生本发明涉及的脂肪酶。
本发明研究证明，嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4(薛燕芬等，系统与环境微生物国际杂志IJSEM，511335-1341，2001)在高温条件下产生高温脂肪酶，其分泌的脂肪酶作用温度范围为60-80℃，pH6-7。
本发明从嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4获得到脂肪酶的基因，它是1209bp的DNA，编码一个由403个氨基酸组成的蛋白质。通过分子生物学方法获得了含有该基因的重组质粒，转化大肠杆菌使重组菌株表达脂肪酶。因此本发明同时提供了一种方法，即通过遗传工程或分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到其它更有利于在生产应用的受体菌上，由其它菌株或在其它培养条件产生本发明涉及的脂肪酶。
为达到本发明的目的，实现本发明的具体技术步骤如下从嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4中提取总DNA，利用shot-gun技术，得到所需要的DNA片段，连接到pUC18载体上并转化大肠杆菌DH5α，获得含高温脂肪酶基因的重组质粒pLIP及重组大肠杆菌菌株DH5αLIP。该重组菌表达高温脂肪酶活性。在可使上述脂肪酶基因表达的条件下培养该重组菌，经活性测定，证明该重组菌表达高温脂肪酶活性。该蛋白质具有高温脂肪酶活性，作用温度60-80℃，pH6-7可水解脂肪产生脂肪酸和甘油。测序表明，目的基因含有1209bp，编码一个由403个氨基酸组成的蛋白质。
本发明涉及的脂肪酶是一新型的脂肪酶。属于脂肪酶Class 2家族中的一员。新的脂肪酶的一级结构与已知的脂肪酶的不同，与其它已报道的脂肪酶的氨基酸序列相比，相似性小于36％。应当指出的是，对本发明的脂肪酶基因所表达的酶分之的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的。因而本发明也包括与SEQNO.2所示的氨基酸序列具有至少有80％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有脂肪酶的活性的功能类似物。
本发明涉及的脂肪酶的性能不同于已知的脂肪酶，其热稳定性高，适合用于洗涤剂添加剂和其他相关工业，如化工、纺织、食品、医药方面应用。
按照本发明所述的脂肪酶，具有如下特性(1)高温厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4或其它衍生菌产生。衍生菌是指转化有本发明涉及的DNA片段的重组菌株；(2)具有SEQ NO.1所示的核苷酸编码序列；(3)具有SEQ NO.2所示的氨基酸序列；(4)具有脂肪酶活性，作用温度60-80℃，pH6-7，分子量42000道尔顿。
本发明涉及的DNA序列，除了编码本发明涉及的脂肪酶的SEQ NO.1外，还应当包括编码对本发明的脂肪酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的DNA核苷酸序列。因而本发明也包括编码与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有80％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有脂肪酶活性的功能类似物的DNA核苷酸序列。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
图1.pLIP质粒的构建图。
具体实施例方式
实施例1.
嗜热厌氧菌MB4总DNA的提取采用从中国云南腾冲热泉分离的嗜热厌氧菌Thermoanaerobactertengcongensis MB4，取其新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50mMTris缓冲液中(pH8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25mMEDTA(pH8.0)，混匀后于37℃放置20min，之后加入2毫升10％SDS，55℃放置5min，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取最后一次的上清溶液，加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，沉淀溶于0.5毫升TE缓冲液(pH8.0，10mM Tris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase3μl，37℃保温1小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，上清液加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，真空干燥，用去离子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.98，A260/A230＝2.18。
脂肪酶基因的克隆取前面所述的总DNA溶液10μl(约50μgDNA)，用限制酶Sau3AI部分酶切，经琼脂糖凝胶电泳，电洗脱回收2-10kbDNA片段。取2μl(5μg)Sau3AI酶解DNA片段与1μl(1μg)经BamHI酶解并脱磷酸化的质粒pUC18DNA在20μl连接体系进行连接反应，其中含2μl(10X连接缓冲液)，1μl T4DNA连接酶，14μl水。连接体系在16℃反应16小时，转化感受态大肠杆菌DH5α后，涂于含50ug/ml Amp(氨苄青霉素)，橄榄油与聚乙烯醇(PVA)的LB固体培养基上。37℃培养16-18小时，然后在60℃培养1-5小时，菌落周围有透明圈的即为阳性克隆。阳性克隆在Amp-LB培养基中37℃培养16-18小时，经活性测试具有耐热脂肪酶活性。对阳性菌落用碱法提取重组质粒，用各种限制酶水解重组质粒，根据电泳结果证实有DNA片段插入质粒，其大小约为3.0kb。含该DNA片段的重组质粒称为pLIP，含此重组质粒pLIP的重组大肠杆菌称为大肠杆菌DH5αLIP.
此重组质粒pLIP可高频转化大肠杆菌表达脂肪酶活性和抗氨苄性能。将重组质粒中的DNA插入片段用地高辛DNA标记检测试剂盒标记，与嗜热菌MB4的染色体DNA进行Southern blot DNA杂交实验，证实重组质粒pLIP中插入的DNA片段来自嗜热菌MB4的染色体DNA。
采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果显示插入片段含有一个长1209bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个由403个氨基酸组成的蛋白质。属脂肪酶Class2家族，最高相似性同Bacillus subtilis的脂肪酶基因(36％)。
实施例2.
重组脂肪酶的纯化和特性重组菌E.coli DH5αLIP的菌体悬于50mM磷酸缓冲液(pH7)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组脂肪酶的粗酶液。此上清酶液70oC加热15分钟，离心去除变性蛋白，上清酶液经离子交换柱层析，羟基磷灰石吸附柱层析和PAGE制备电泳等步骤进行纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组脂肪酶的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量为42000道尔顿，与理论上推算的分子量(45200道尔顿)相似；重组酶反应的作用温度为60-80℃，pH6-7。
实施例3重组脂肪酶水解橄榄油向50％的橄榄油溶液(用pH7，0.2M的磷酸钠缓冲液配制)中，加适量酶液，升温至60℃，以每分钟200转搅拌16小时。色谱法测得油相含有脂肪酸，水相含有甘油，说明重组脂肪酶可水解橄榄油产生甘油和脂肪酸。
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院微生物研究所<120>一种高温脂肪酶、其编码基因序列及其应用<130>IM021104<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1212<212>DNA<213>Thermoanaerobacter tengcongensis MB4<400>1atgaggaagc taagagtatt tcctctattg gtaataatgt cgttgttatt atttcaagga60cattataaag caacatcata ttttgatcca acaccagtaa aaacctttac cgactctaaa120tactgggcta aagtggaact tttgagagat agcaatccta atataggaca agaaaaattt180ataacagata atcaacaaaa agatccagaa attatcaaag aatttaacaa caatcctcaa240ccaaattcac aatatttttt gctccactat gcacccggtt gggatacagg cacaaagcca300tatcctgtaa ttcttgttca cggtgctggg tccgatgcaa acttttttgc agatcctaaa360agggatggtt cgattactgg tttgatgcaa tatctttcgc aaagaggtta taaagtcttt420gctgttacat ttgcgcatcc tcatggggac aattacattc aaagagagat tcttgctgat480gtgattcaga aggttaaggc tgtaacagga gcaagtaaag ttgatattgt agcacatagt540aaaggcaata tgtccgcaag aatgtacgtg tcaaatgtca aagaatcatg gggagttgat600tttggaaaag atgtgagaag atatatccag ctgggagctc caaatggtgg aattgacttt660acttttagga atccaaatat ggcatggggt ataatgacaa ctggaggatt tggacctgtt720ccttatactt atatgttgat ttatggatta tggtataata ccacctatca cagtatatat780acagaaggtg gtgcctatcc aggacaactt cagatgctag caagatggga tagtgtatat840cctctaaata caacgcagca agattggtat acaacttatt atggagggtg gggatttgct900agttattcct atggaataaa ttatgcaatt aaagaaggcg gaaatcttgt taatacatta960
cagaattccc ctgtagatcc ttctgtagaa atagctgtgt tggctggaga ttataattat 1020ataaatggtg ttccgtggga gaccacaggg cccagtgatg gattagtatt tgtaaaaagt 1080gctactgata catcggcaat gacaaaatca ggggcaaaac ttttagcgaa agacgtatac 1140catttaaatc accttgagct ggcatatgat aaatcagcta tggattggat agatgcacaa 1200ttgtcaaaat ga 1212<210>2<211>403<212>PRT<213>Thermoanaerobacter tengcongensis MB4<400>2Met Arg Lys Leu Arg Val Phe Pro Leu Leu Val Ile Met Ser Leu Leu1 5 10 15Leu Phe Gln Gly His Tyr Lys Ala Thr Ser Tyr Phe Asp Pro Thr Pro20 25 30Val Lys Thr Phe Thr Asp Ser Lys Tyr Trp Ala Lys Val Glu Leu Leu35 40 45Arg Asp Ser Asn Pro Asn Ile Gly Gln Glu Lys Phe Ile Thr Asp Asn50 55 60Gln Gln Lys Asp Pro Glu Ile Ile Lys Glu Phe Asn Asn Asn Pro Gln65 70 75 80Pro Asn Ser Gln Tyr Phe Leu Leu His Tyr Ala Pro Gly Trp Asp Thr85 90 95Gly Thr Lys Pro Tyr Pro Val Ile Leu Val His Gly Ala Gly Ser Asp100 105 110Ala Asn Phe Phe Ala Asp Pro Lys Arg Asp Gly Ser Ile Thr Gly Leu115 120 125
Met Gln Tyr Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Lys Val Phe Ala Val Thr Phe130 135 140Ala His Pro His Gly Asp Asn Tyr Ile Gln Arg Glu Ile Leu Ala Asp145 150 155 160Val Ile Gln Lys Val Lys Ala Val Thr Gly Ala Ser Lys Val Asp Ile165 170 175Val Ala His Ser Lys Gly Asn Met Ser Ala Arg Met Tyr Val Ser Asn180 185 190Val Lys Glu Ser Trp Gly Val Asp Phe Gly Lys Asp Val Arg Arg Tyr195 200 205Ile Gln Leu Gly Ala Pro Asn Gly Gly Ile Asp Phe Thr Phe Arg Asn210 215 220Pro Asn Met Ala Trp Gly Ile Met Thr Thr Gly Gly Phe Gly Pro Val225 230 235 240Pro Tyr Thr Tyr Met Leu Ile Tyr Gly Leu Trp Tyr Asn Thr Thr Tyr245 250 255His Ser Ile Tyr Thr Glu Gly Gly Ala Tyr Pro Gly Gln Leu Gln Met260 265 270Leu Ala Arg Trp Asp Ser Val Tyr Pro Leu Asn Thr Thr Gln Gln Asp275 280 285Trp Tyr Thr Thr Tyr Tyr Gly Gly Trp Gly Phe Ala Ser Tyr Ser Tyr290 295 300Gly Ile Asn Tyr Ala Ile Lys Glu Gly Gly Asn Leu Val Asn Thr Leu305 310 315 320
Gln Asn Ser Pro Val Asp Pro Ser Val Glu Ile Ala Val Leu Ala Gly325 330 335Asp Tyr Asn Tyr Ile Asn Gly Val Pro Trp Glu Thr Thr Gly Pro Ser340 345 350Asp Gly Leu Val Phe Val Lys Ser Ala Thr Asp Thr Ser Ala Met Thr355 360 365Lys Ser Gly Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asp Val Tyr His Leu Asn His370 375 380Leu Glu Leu Ala Tyr Asp Lys Ser Ala Met Asp Trp Ile Asp Ala Gln385 390 395 400Leu Ser Lys
权利要求
1.一种来源于嗜热菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4的高温脂肪酶或其功能类似物，其氨基酸序列与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有80％的同源性。
2.根据权利要求1所述的酶或其功能类似物，其氨基酸序列与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有90％的同源性。
3.根据权利要求1所述的酶或其功能类似物，它具有SEQ NO.2所示的氨基酸序列。
4.一种编码权利要求1至3中任意一项所述的高温脂肪酶或其功能类似物的基因。
5.根据权利要求4所述的基因，它具有SEQ NO.1所示的核苷酸序列。
6.一种含有权利要求5所述的核苷酸序列的重组质粒，是pLIP。
7.一种含有权利要求4或5所述的高温脂肪酶或其功能类似物的基因的表达载体。
8.一种含有权利要求7所述表达载体的重组菌。
9.一种含有权利要求7所述表达载体的重组大肠杆菌DH5αLIP。
10.一种制备高温脂肪酶的方法步骤和用途，包括(1)按照权利要求8所述的重组菌；(2)按照权利要求8所述的重组菌是一种含重组质粒pLIP的重组大肠杆菌DH5αLIP；(3)重组菌通过微生物发酵和酶工程制备高温脂肪酶；(4)通过该方法得到的高温脂肪酶在化工、纺织、食品、医药工业方面应用。
全文摘要
由嗜热菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4总DNA获得高温脂肪酶基因(Lipase gene)，构建了原核表达质粒，转化大肠杆菌表达脂肪酶。通过氨基酸序列比较，该酶为一新型脂肪酶。
文档编号B62D25/00GK1500868SQ02148778
公开日2004年6月2日 申请日期2002年11月19日 优先权日2002年11月13日
发明者薛燕芬, 马延和, 窦岳坦, 周培瑾 申请人:中国科学院微生物研究所