，1，4, 7, 7-五甲基二亚己基Η胺按照摩尔比 100;1;1. 5的比例加入甲醇中，超声处理使其溶解并混合均匀。将上述反应液与表面已固 定了SI-ATRP引发剂的硅胶填料混合，采用冷冻-抽真空-解冻-冲氮气的方法除去体系 中的氧气，如此循环3次，之后用封口膜封口，于室温在硅胶填料的表面原位引发ST-ATRP 反应8小时。反应完成后反复用甲醇清洗、去除剩余反应物，得到SBM共聚物修饰的硅胶 填料。之后，WGMAG为聚合单体，采用相同反应条件重复上述实验流程，再次引发SI-ATRP 反应8小时。反应完成后反复用甲醇清洗、去除剩余反应物，得到GMG-SBM嵌段共聚物修 饰的硅胶填料。之后，WGMAM为聚合单体，重复上述实验流程，最终得到GMAM-GMAG-SBMA 嵌段亲水共聚物修饰的硅胶填料。
[0031] 取上述方法所得色谱填料和未经修饰的硅胶颗粒分别进行扫描电镜分析，所得结 果见图2。由图2可知，多组分嵌段亲水共聚物-硅胶杂化填料（a)与未经修饰的硅胶填料 (b)的表面形态有明显区别。未修饰的硅胶填料表面光滑，而多组分嵌段亲水共聚物-娃 胶杂化填料表面的共聚物层高度粗糖，由纳米尺度的颗粒和大量孔隙所组成。证明通过 SI-ATRP法在硅胶颗粒表面修饰亲水共聚物是成功的。
[0032] 分别称取lOOmg不同嵌段聚合阶段的多组分嵌段亲水共聚物-硅胶杂化填料和未 经修饰的硅胶填料，进行热重分析，所得结果见图3。
[0033] 由于多组分嵌段亲水共聚物-硅胶杂化填料由可热分解从而导致质量损失的共 聚物层和不可热分解的硅胶颗粒核必两部分组成。故从图3中可看出，（a)未修饰共聚物 的硅胶颗粒随热处理温度的提高无明显质量损失，而（b)SBMA共聚物修饰的硅胶填料，（C) GMAG-SBMA嵌段共聚物修饰的硅胶填料，（d)GMAM-GMAG-SBMA嵌段共聚物修饰的硅胶填料 在200-60(fC的范围内表现出明显的质量损失，而且质量损失随嵌段聚合阶段的进行而成 比例增加。最终质量损失可达22%。证明通过连续SI-ATRP法在硅胶颗粒表面原位顺序聚 合不同种类单体，生成多组分嵌段亲水共聚物是成功的。
[0034] 实施例2 利用实施例1所得色谱填料进行糖肤的富集： 1)取lOmg实施例1制备所得色谱填料用己腊溶解，装填到20〇μ1移液器枪头里，自然 沉淀，制备固相萃取柱； 2)称取适量去唾液酸牛胎球蛋白/牛血清白蛋白，溶解于50mM碳酸氨倭溶液中，终浓 度为1μg/μ1。加入终浓度为lOmM的琉基己醇，56°C水浴中还原1小时，之后加入IAA于 暗处放置1小时将蛋白变性。取变性蛋白按质量比1:50(膜蛋白酶；蛋白质）加入膜蛋白 酶，放置于37°C水浴赔育12小时后加入0. 1%TFA将膜蛋白酶灭活，得到酶解产物。
[0035] 将所得酶解后得到的去唾液酸牛胎球蛋白与牛血清白蛋白的肤段产物按摩尔比 1; 10混合后均分为两份，一份冷冻干燥后用己腊/水/甲酸（80:20:0.1，v/v)重溶，终浓 度1μg/μ1。将该固相萃取柱用30μ1己腊/水/甲酸（10 : 90 : 0. 1，v/v)溶液润洗，60μ1 己腊/水/甲酸（80:20:0.1，v/v)溶液平衡后，取10μ1酶解产物上样，己腊/水/甲酸 (80:20:0. 1，v/v)溶液洗涂3次，最后用30μ1己腊/水/甲酸（10:90:0. 1，v/v)溶液洗脱。 洗脱液中加入50mM碳酸氨倭后，加入PNGaseF酶(酶和蛋白的质量比为1:10)，置于37°C 水浴中赔育16小时。
[0036] 向上述另一份膜蛋白酶酶解产物中直接加入PNGaseF酶(酶和蛋白的质量比为 1:10)，置于37°C水浴中赔育16小时。
[0037] 分别从未经富集和经固相萃取柱富集后的PNGaseF酶解产物中取1 μ 1样品点于 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪祀上，干燥后，点上α-氯基-4-居基肉桂酸溶液 (50%己腊，0.1%FA作为基质，待祀上溶液结晶后进行质谱分析。所得结果图如4所示，谱 图中的质谱峰均为去糖链后的糖肤。
[0038] 由图可知，（a)未经富集的样品的MLDI-TOF-MS质谱图中存在大量有牛血清白蛋 白酶切肤段所引入的非糖肤信号干扰，导致糖肤信号被严重抑制，难W检测； 而（b)经多组分共聚物-硅胶杂化色谱填料填装的固相萃取柱富集后的样品的MLDI-TOF-MS质谱图中，非糖肤和其他杂质的信号基本被去除，糖肤的信号强度和信噪比 均获得明显提高，并鉴定到了去唾液酸牛胎球蛋白的全部3条糖基化肤段。说明由此色谱 填料装填的固相萃取柱对糖肤尤具有明显富集效果，基本在存在大量非糖肤干扰的条件下 仍可获得极高的富集选择性。
[00測 实施例3 利用实施例1所得多组分共聚物-硅胶杂化色谱填料进行小鼠肝脏全蛋白中糖肤的富 集： 1) 取lOmg实施例1制备所得色谱填料用己腊溶解，装填到200μ1移液器枪头里，自然 沉淀，制备固相萃取柱； 2) 取50μg小鼠肝脏全蛋白，溶解于50mM碳酸氨倭溶液中，终浓度为2μg/μ1。 沸水浴热变性10分钟后，冷却到室温，取适量变性蛋白加入PNGaseF酶(酶和蛋白质质 量比为1:10)，置于37°C水浴中赔育16小时。酶解产物冷冻干燥后用己腊/水/甲酸 (80:20:0.l，v/v)溶解，终浓度为2ug/ul。富集过程如下： (1) 材料活化和平衡：用10倍体积的20%的甲醇水溶液润洗活化；用己腊/甲醇/水 溶液（75 ;10 ;15,v/v/v)平衡Η次； (2) 上样富集；将活化、平衡好的杂化填料中加入肤段溶液，室温震荡2h; (3) 装填小柱；富集2h后，8000g离必，弃上清，己腊/水（75/25,v/v)溶液重溶， 湿法装填小柱； (4) 淋洗；用杂化填料10倍体积的己腊/甲醇/水/甲酸（80 ;10 :10:0. 1，v/v/v)洗 涂，重复3-5次； (5) 洗脱；加入30ul的己腊/水/甲酸（20:75:5，v/v/v)溶液，分3次洗脱亲水材料 上吸附的糖肤，收集洗脱液，冷冻干燥； (6) 酶切去糖：糖肤重溶于50mM畑4肥03溶液中，加入PNGaseF酶（20μg蛋白加入1 unit酶)，37°C水浴过夜。
[0040] 切糖处理后的糖肤需经过sep-Pakcartridge(Waters)脱盐小柱脱盐。脱盐步 骤按照说明书操作，主要步骤为柱体的活化，平衡，上样，淋洗，洗脱。洗脱液冷冻干燥后，用 液相色谱A液重溶（98%+2%己腊+0. 1%FA)，液相色谱-质谱联用检测。从Η次重复鉴定结 果的文氏图中可W看出，参照图5,多组分嵌段亲水共聚物-硅胶杂化填料具有较强的富集 选择性和富集效率，鉴定结果中如（a)所示70%为糖肤，明显高于富集前约1%和经常规亲 水色谱填料富集后约如（b)所示50%的糖肤富集选择性。Η次重复实验中共计富集-鉴定 到1244个糖化对应577个糖蛋白。其中70. 8%和82.0%的糖肤和糖蛋白在至少两次实验 中被重复鉴定到，充分说明上述色谱填料具有较好的富集重现性。经与使用单一种类单体 (SBMA、GMAG或GMAM中的任意一种）SI-ATRP聚合制备生成的单组分亲水共聚物-硅胶杂 化填料的富集效率比较后发现，多组分嵌段亲水共聚物-硅胶杂化填料除了明显具有更高 的富集效率，将糖蛋白、糖肤的鉴定规模分别提高了 50-90%和80-120%，如图6所示W外， 还具有更好的富集广谱性。Η种单组分亲水共聚物-硅胶杂化填料的富集鉴定结果中，超 过85%的糖肤和超过90%的糖蛋白都被多