专利名称：间接elisa方法快速检测近江牡蛎病原类立克次氏体的制作方法
技术领域：
本发明属水产学科生物技术领域，即应用现代免疫学技术——间接ELISA技术来解决海水养殖近江牡蛎(拉丁学名为Crassostrea ariakensis Gould)发生的类立克次氏体病的病原检测问题，本发明就是创造了检测引起近江牡蛎发病死亡的类立克次氏体(英文名称rickettsia-like prokaryote，简称RLP或者又称为rickettsia-like organism，简称RLO)的间接ELISA(英文名称Enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA)检测方法。
背景技术：
海水养殖近江牡蛎是一种浅海养殖的重要经济贝类，在我国广东、广西、福建、海南等南方诸省有大规模养殖，其味美肉细，营养丰富，在正常情况下，产量高，经济效益好。但自1992年以来，养殖牡蛎常有大规模的暴发性死亡，广东和广西两省尤其严重，一般发生在每年的3-5月份和10-12月份，死亡率达80-90％，这造成了巨大的经济损失。2000年我们首次报道了近江牡蛎的类立克次氏体感染，发现类立克次氏体是引起近江牡蛎发病的病原。在本发明之前，迄今在国内、外尚未见用间接ELISA方法来检测近江牡蛎的类立克次氏体。
在本发明之前，为了检测近江牡蛎的发病情况，原来已有的技术仍然是停留在组织学切片和电子显微镜超薄切片的水平上，通过光学显微镜来检查类立克次氏体的包涵体或通过电子显微镜来直接观察寻找病原体，这种方法费时费力，试剂及设备昂贵。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供一种能早期、快速、有效地检测出引起近江牡蛎暴发性死亡病原类立克次氏体的方法。
为实现上述目的采取技术方案的操作步骤依次如下第一、待检材料的准备分别取近江牡蛎的鳃，外套膜，肝胰腺研磨后加入3倍体积的生理盐水，离心取上清液检测。
第二、抗原的制备1.类立克次氏体的初步分离取近江牡蛎鳃组织，剪碎后加入pH为7.4的PBS，于匀浆器内匀浆10min，重复匀浆三次。先低速离心除渣。4℃下500g离心10min，取上清液。沉淀加入PBS后重新研磨匀浆，4℃下400g离心20min，取上清液，弃沉淀。将上两步的上清液收集后4℃下11000g离心60min。用吸管吸去浮在管壁上的脂肪，弃掉上清液。沉淀加入PBS后，重新匀浆(动作要缓慢)，4℃下500g离心20min，取上清液置于23％蔗糖和10％泛影葡胺的混合溶液之上，4℃下25000g离心60min，将沉淀轻微匀浆后，PBS稀释，4℃下400g离心10min，取上清液后，4℃下再11000g离心60min，取沉淀，用9ml PBS稀释为类立克次氏体粗提液。离心后的每一步含有类立克次氏体的液体涂片，Giemsa染色，光学显微镜观察。
2.泛影葡胺密度梯度离心纯化类立克次氏体用国产泛影葡胺(60％)配制15％、20％、25％、30％、35％的泛影葡胺，按浓度由高到低依次加入离心管中，形成非连续梯度。将类立克次氏体粗提液加在泛影葡胺密度梯度上，4℃下90000g离心60min，形成5条窄的乳白色的条带，分别取出经电镜观察，证明20％与25％之间和25％与30％之间基本上为纯净的类立克次氏体。
第三、免疫血清的制备及非特异性抗体的吸收1.多克隆抗血清的制备类立克次氏体经超声处理后，用PBS调整为1μg蛋白/μl，加等量的弗氏完全佐剂进行乳化。在Balb/c小鼠4个位点分别皮下注射100μl免疫乳化剂，4周后作加强免疫，腹腔注射100μl不加佐剂的抗原，10天后在小鼠尾静脉采血，检测抗体。
2.非特异性抗体的吸收取正常贝的闭壳肌，加入TN缓冲液(其中含有PMSF 1mmol/dm3)，匀浆8000rpm，10min，经3000rpm离心5min，取上清液再经5000rpm离心20min，上清液经10000rpm离心1h，取沉淀用于非特异性抗体的吸收。方法参照Sambrook等。
第四、间接ELISA工作浓度的确定1.免疫血清抗体的效价固定抗原的浓度10μg/ml，系列稀释抗血清的浓度1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800用间接ELISA技术测定抗体效价及最佳工作浓度。
2.采用交叉连续稀释法确定免疫血清的最佳工作浓度。抗原浓度恒定100μg/ml，调节免疫血清的稀释度1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800。经间接ELISA反应后，在λ＝450处的吸收值见图1。
由图1可见，制备的免疫血清用间接ELISA测定的效价为1∶6400(v/v)，最佳工作浓度取最大和最小吸收值的中间值，为0.6，对应的血清稀释度为1∶3200；过高和过低的稀释度都会增加非特异吸附。
第五、间接ELISA方法的敏感性和特异性验证(1)敏感性实验根据确定的一抗最佳工作浓度和二抗推荐的工作浓度，系列稀释抗原浓度，以确定最小检测的抗原浓度。
实验中，免疫血清抗体的浓度恒定(1∶3200V/V)；酶标二抗的工作浓度恒定(1∶20000V/V)。而抗原的浓度改变(1ng/ml-50μg/ml)，测定免疫血清对抗原的灵敏度，结果如图2，由图2可见，用此方法可测得50ng的抗原蛋白量。
(2)特异性实验 选择溶澡弧菌(V.Alginolyticus)、嗜水气单胞菌(AeromonasHydrophila)、大肠杆菌(Eschenrichia Coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)、枯草杆菌(Bacillus Subtilis)与多克隆抗血清交叉反应来判断抗血清的特异性。实验细菌的浓度为106/ml。
由类立克次氏体免疫Balb/c小鼠所得的抗血清与类立克次氏体的效价为1∶12800，与其它菌的效价较低，都低于1∶200，通过吸附处理后，抗血清对类立克次氏体的效价降低至1∶6400，与其它菌无交叉反应，为高度专一的抗类立克次氏体血清。
第六、近江牡蛎类立克次氏体病原的检测于发病高峰期取近江牡蛎，取其外套膜和鳃部位组织，用无菌PBS匀浆，离心取上清液，100℃煮沸10min，4℃保存。
用碳酸缓冲液(pH9.6，0.01M)将可溶性抗原稀释成蛋白含量为100μg/ml。于微量反应板各孔加100μl稀释的可溶性抗原，4℃18小时后取出，弃去包被液，用PBST洗涤一次，加入3％牛血清白蛋白-0.02％T，37℃作用2小时后，甩干封闭液，用PBST洗涤三次，10min/次，并甩干。
加入被检血清用PBS把血清用倍比稀释后加入反应孔，每孔100μl，37℃作用1小时后用PBST洗涤三次，10min/次，并甩干。
加入酶标二抗，每孔100μl，37℃作用1小时后用PBST洗涤三次，3min/次，并甩干。
加入四甲基联苯胺TMB显色液，每孔100μl，室温作用15min后加3M NaOH终止反应。测定OD450值，或根据阳性及阴性对照直接判定结果。
显色液配方
碳酸缓冲液(pH9.6)NaHCO32.93g，Na2CO31.59g蒸馏水1L。
封闭液3％牛血清白蛋白-0.02％Tween20。
稀释液PBS(pH7.4)-0.05％Tween20，配方为NaCl 8g，Na2HPO4-12H2O 20g，KH2PO40.2g，KCl 0.2g，H2O 1L。
底物溶液0.2M Na2HPO4(28.4g/L) 25.7ml，0.1M柠檬酸(19.2g/L) 24.3mlH2O 50ml30％H2O2(临用前加入) 15μlTMB(临用前加入) 40mg本发明的优点本发明建立的间接ELISA方法，简单，快速，经济，敏感性高，特异性强，重复性好，便于推广应用，能有效的检出感染材料中的类立克次氏体病原，适用于大批量发病样本的检测，可用于类立克次氏体感染的早期快速诊断及流行病学研究。
图1为间接ELISA技术测定不同稀释度的免疫血清由图1可见，制备的免疫血清用间接ELISA测定的效价为1∶6400(v/v)，最佳工作浓度取最大和最小吸收值的中间值，为0.6，对应的血清稀释度为1∶3200；过高和过低的稀释度都会增加非特异吸附。
图2为不同抗原稀释度的ELISA检测结果免疫血清抗体的浓度恒定(1∶3200V/V)；酶标二抗的工作浓度恒定(1∶20000V/V)。而抗原的浓度改变(1ng/ml-50μg/ml)，测定免疫血清对抗原的灵敏度，结果如图2可见，用此方法可测得50ng的抗原蛋白量。
具体实施例方式
按上述技术方案的实际操作步骤进行的实施例的检测结果，表明采用本发明是有效的利用建立的ELISA方法对患病近江牡蛎的鳃组织进行检测，以经过组织学和透射电镜检测为类立克次氏体阴性的健康近江牡蛎做阳性对照，对50份自然发病的近江牡蛎鳃组织进行检测，结果是ELISA检测阳性率为89％。
权利要求
1.间接ELISA方法快速检测近江牡蛎病原类立克次氏体，其特征在于检测步骤依次如下一、待检材料的准备分别取近江牡蛎的鳃，外套膜，肝胰腺研磨后加入3倍体积的生理盐水，离心取上清液检测；二、抗原的制备1.类立克次氏体的初步分离取近江牡蛎鳃组织，剪碎后加入pH为7.4的PBS，于匀浆器内匀浆10min，重复匀浆三次，先低速离心除渣，4℃下500g离心10min，取上清液，沉淀加入PBS后重新研磨匀浆，4℃下400g离心20min，取上清液，弃沉淀，将上两步的上清液收集后4℃下11000g离心60min，用吸管吸去浮在管壁上的脂肪，弃掉上清液，沉淀加入PBS后，重新匀浆，4℃下500g离心20min，取上清液置于23％蔗糖和10％泛影葡胺的混合溶液之上，4℃下25000g离心60min，将沉淀轻微匀浆后，PBS稀释，4℃下400g离心10min，取上清液，4℃下11000g离心60min，取沉淀，用9mlPBS稀释为类立克次氏体粗提液，离心后的每一步含有类立克次氏体的液体涂片，Giemsa染色，光学显微镜观察；2.泛影葡胺密度梯度离心纯化类立克次氏体用国产泛影葡胺(60％)配制15％、20％、25％、30％、35％的泛影葡胺，按浓度由高到低依次加入离心管中，形成非连续梯度，将类立克次氏体粗提液加在泛影葡胺密度梯度上，4℃下90000g离心60min，形成5条窄的乳白色的条带，分别取出经电镜观察，证明20％与25％之间和25％与30％之间基本上为纯净的类立克次氏体；三、免疫血清的制备及非特异性抗体的吸收1.多克隆抗血清的制备类立克次氏体经超声处理后，用PBS调整为1μg蛋白/μl，加等量的弗氏完全佐剂进行乳化，在Balb/c小鼠4个位点分别皮下注射100μl免疫乳化剂，4周后作加强免疫，腹腔注射100μl不加佐剂的抗原，10天后在小鼠尾静脉采血，检测抗体；2.非特异性抗体的吸收取正常贝的闭壳肌，加入TN缓冲液其中含有PMSF1mmol/dm3，匀浆8000rpm，10min，经3000rpm离心5min，取上清液再经5000rpm离心20min，上清液经10000rpm离心1h，取沉淀用于非特异性抗体的吸收，方法参照Sambrook等；四、间接ELISA工作浓度的确定1、免疫血清抗体的效价固定抗原的浓度10μg/ml，系列稀释抗血清的浓度1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800用间接ELISA技术测定抗体效价及最佳工作浓度；2、采用交叉连续稀释法确定免疫血清的最佳工作浓度，抗原浓度恒定100μg/ml，调节免疫血清的稀释度1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800。经间接ELISA反应后，获得在λ＝450处的吸收值；制备的免疫血清用间接ELISA测定的效价为1∶6400v/v，最佳工作浓度取最大和最小吸收值的中间值，为0.6，对应的血清稀释度为1∶3200；五、间接ELISA方法的敏感性和特异性验证1、敏感性根据确定的一抗最佳工作浓度和二抗推荐的工作浓度，系列稀释抗原浓度，以确定最小检测的抗原浓度；免疫血清抗体的浓度恒定1∶3200V/V；酶标二抗的工作浓度恒定1∶20000V/V，而抗原的浓度改变范围为1ng/ml-50μg/ml，测定免疫血清对抗原的灵敏度；2、特异性选择溶澡弧菌V.Alginolyticus、嗜水气单胞菌Aeromonas Hydrophila、大肠杆菌EschenrichiaColi、金黄色葡萄球菌Staphylococcus Aureus、枯草杆菌Bacillus Subtilis与多克隆抗血清交叉反应来判断抗血清的特异性，实验细菌的浓度为106/ml；由类立克次氏体免疫Balb/c小鼠所得的抗血清与类立克次氏体的效价为1∶12800，与其它菌的效价较低，都低于1∶200，通过吸附处理后，抗血清对类立克次氏体的效价降低至1∶6400，与其它菌无交叉反应，为高度专一的抗类立克次氏体血清；六、近江牡蛎类立克次体病原的检测于发病高峰期取近江牡蛎，取其外套膜和鳃部位组织，用无菌PBS匀浆，离心取上清液，100℃煮沸10min，4℃保存；用碳酸缓冲液pH9.6 0.01M将可溶性抗原稀释成蛋白含量为100μg/ml，于微量反应板各孔加100μl稀释的可溶性抗原，4℃18小时后取出，弃去包被液，用PBST洗涤一次，加入3％牛血清白蛋白-0.02％T，37℃作用2小时后，甩干封闭液，用PBST洗涤三次，10min/次，并甩干；加入被检血清用PBS把血清用倍比稀释后加入反应孔，每孔100μl，37℃作用1小时后用PBST洗涤三次，10min/次，并甩干；加入酶标二抗，每孔100μl，37℃作用1小时后用PBST洗涤三次，3min/次，并甩干；加入四甲基联苯胺TMB显色液，每孔100μl，室温作用15min后加3M NaOH终止反应，测定OD450值，或根据阳性及阴性对照直接判定结果；其中显色液配方碳酸缓冲液(pH9.6)NaHCO32.93g，Na2CO31.59g蒸馏水1L；封闭液3％牛血清白蛋白-0.02％Tween20；稀释液PBS(pH 7.4)-0.05％Tween20，配方为NaCl 8g，Na2HPO4-12H2O 20g，KH2PO40.2g，KCl 0.2g，H2O 1L；底物溶液0.2M Na2HPO428.4g/L 25.7ml，0.1M 柠檬酸 19.2g/L 24.3mlH2O 50ml30％H2O2临用前加入 15μlTMB临用前加入 40mg。
全文摘要
间接ELISA方法快速检测近江牡蛎病原类立克次氏体。主要解决能简单、快速、敏感性高、特异性强、重复性好的检测出引起近江牡蛎发病死亡的类立克次氏体。其检测步骤依次如下待检材料的制备、抗原的制备、免疫血清的制备及非特异性抗体的吸收、间接ELISA工作浓度的确定、间接ELISA方法的敏感性和特异性验证，最后进行近江牡蛎类立克次氏体病原的检测。本发明能有效检出感染材料中的类立克次氏体病原，适用于大批量发病样本的检测，可用于类立克次氏体感染的早期快速诊断及流行病学研究。
文档编号G01N33/535GK1616968SQ200410066928
公开日2005年5月18日 申请日期2004年9月30日 优先权日2004年9月30日
发明者吴信忠, 孙敬锋 申请人:浙江大学