专利名称：：半定量快速检测氧化低密度脂蛋白的胶体金试纸条及制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种半定量快速检测人血浆中氧化低密度脂蛋白(OXLDL)含量的免疫胶体金试纸条。
背景技术：
：心脑血管疾病是导致人类死亡首位原因，而动脉粥样硬化(As)又是大多数心脑血管疾病发生的前期病理基础，故研究动脉硬化的发病机理、诊断和防治方法已经成为医学界研究的热点。流行病学调查和医学临床研究都发现并证实高脂血症与动脉粥样硬化之间存在密切的关系[1]。众所周知，动脉粥样硬化最主要的病理学标志是泡沫细胞的形成，而OXLDL又是泡沫细胞形成的关键。新近的研究表明，在动脉粥样硬化的病灶中发现了OXLDL的沉积，而正常动脉壁中没有[2，3]，属AS病灶中的特有成分，血浆OXLDL增高与动脉粥样硬化性心血管病(ASCVD)的发生率和死亡率有密切关系。由于OXLDL系As病灶中特有的成份，患者体内的含量远高于正常人，其浓度与病变范围成比例，对ASCVD的辅助诊断价值优于TC(总胆固醇)、TG(甘油三酯)、APO-B(载脂蛋白B)和LP(a)(脂蛋白(a))[4]。临床上检测OXLDL的水平，①可间接地反映病人的病变程度.随着As的发展，免疫组化显示OXLDL越来越多地沉积于细胞外基质中，尤其是纤维帽区及脂质核心、粥样坏死区。定量检测结果也表明在As不同时期OXLDL含量有显著性差异。病变越到晚期，OXLDL的含量越高。②将有利于动脉硬化性疾病的辅助诊断。对于那些OXLDL值升高而临床尚未出现心脏血管动脉硬化症状者.可起到一定的预警作用[5]。③测定血中氧化型低密度脂蛋白的水平，是抗氧化和抗低密度脂蛋白(LDL)修饰治疗的重要依据，也是治疗效果监测指标，为预防和治疗心脏血管疾病找到了一条新的措施[6]。临床认为健康人体内OXLDL含量在200-500μg/L之间，当临床上检测OXLDL含量大于600ug/L时认为异常[7，8]。由于OXLDL是As病灶中特有的成份，它对ASCVD辅助诊断的特异性要优于常规血脂项目，故OXLDL的检测对ASCVD的早期辅助诊断具有极其重要的意义。检测OXLDL的方法很多[9，10]，最常用的方法是采用OXLDL单抗或多抗的酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清OXLDL的含量[10，11]。该方法的缺陷是需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用；检测操作人员需要经过专业培训；操作过程相对比较复杂，检测所需费用较高，不能实现单人分检测。随着疾病诊断向着简便、快速、灵敏的方向发展，很多疾病实现了用金标快速诊断试剂进行检测。但是绝大多数胶体金试纸条都是定性检测，没有实现半定量检测。半定量快速检测氧化低密度脂蛋白的胶体金试纸条既具有ELISA酶法的高灵敏度，又具有半定量功能，能够取代传统机器检测定量的地位，大幅降低检测成本。对于体外快速检测血浆中氧化低密度脂蛋白的含量是很有意义的。参考文献1、郭刚等.低密度脂蛋白的分离提纯和鉴定.天津医学院学报1997年第15卷第1期，16-19.2、YlaHerttualas，PalinskiW，RosenfeldME，etal.Lipoproteinsinnormolandatherosclerosicaorra.EurHeartJ，1990，11[SupplE]88-99.3、BoydHC，GownAM，Wodlbaner，etal.DirectevidenceforaproteinrecognizedbyamonnoclonnalantibodyagainstoxidativelymodifiedLDLinatherosclerosislesionsfromaWatanabeheritablehyperlipidemicrabbits.AmJPathol，1989，136815.4、YlaHerttualaS，PalinskiW，RosenfeldME，etal.Evidenceforthepresenceofoxidativelymodifiedlowdensitylipoproteininatheroscleroticlesionsofrabbitandman.JCIinInvest，1993，841086.5、BoydHC，GownAM，Wodfbaner，etal.DirectevidenceforproteinrecognizedbyamonocolonalantibodyagainstoxidativelymodifiedLDLinatheroselerosislesionsfromawatanableheritablehyperlipidemicrabbits.AmJPathol，1992，36815.6、丁振华.低密度脂蛋白的氧化修饰及其理化、生物学性质的改变.国外医学生理、病理学与临床分册，1994，14108.7、苏宝鑫，李淑翠等.动脉硬化患者氧化型低密度脂蛋白的定量研究.江西医学检验，2000年第18卷第1期，19-20.8、张晓钢，陈运贞等.血浆氧化低密度脂蛋白测定的临床价值.临床心血管病杂志，2002年12月第18卷第12期，613-616.9、杨成玉等.氧化低密度脂蛋白的临床研究进展.国外医学临床生物化学与检测学分册，2000年第21卷第一期，18-19.10、RifaiN，WarnickGR，DorniniczaxMH.Handbookoflipproteintesting.WashingtonDCAACC，1997，357-372.11、王华梁，王笑利等.双抗夹心法检测血浆氧化修饰型低密度脂蛋白.上海医学检验杂志1994年第9期第三卷，135-136.
发明内容本发明的目的就是为了弥补当前检测技术的不足，提供一种快速、简便、敏感、经济、特异的、不需要特定仪器设备辅助的氧化低密度脂蛋白金标快速诊断试纸条，并能根据氧化低密度脂蛋白抗体捕获抗原的量建立颜色对浓度关系，迅速判定人血浆中OXLDL定性及半定量检测结果(高于或等于或低于标准对比氧化低密度脂蛋白样品的浓度)，实现对动脉粥样硬化性心血管病(ASCVD)的早期辅助诊断。试纸的基本原理和制作和装配方法参照中国发明专利申请2005102002271。该试纸的制备装配方法包括以下步骤(1)选择所标记单抗最适纳米金颗粒大小(5nm～40nm)。(2)将所需金标记蛋白测定最适蛋白标记量。(3)大量制备所选粒度的纳米金蛋白溶胶。(4)裁剪层析膜(硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜或玻璃纤维素膜)成规定大小，中间作0.8～1mm窄缝，要求平行于膜侧边，缝距两边等距，缝长10～15mm。(5)固定膜于PVC板，固定海绵吸水端，固定探样区海绵吸水垫。(6)点样在膜的检测区和对比质控区。(7)最后将加入金标蛋白的吸水海绵装配上PVC板。其具体细节和具体的制作和装配方法参照后面的具体实施方式，其式样参见说明书附图1。与现有技术相比，本发明具有突出的优点和实用性①亲和性好(特异性好、灵敏度高)，准确性高；②稳定性好，批内/批间差小，易于质量控制；③以胶体金为指示剂，本身形成免疫分析过程后的颜色标记；④操作简便，无需仪器设备，实现半定量检测；⑤符号显示结果，自带质控对照；⑥单体操作，经济实用；⑦摆脱冷链，易运输、储藏。具体实施例方式实施例一半定量快速检测氧化低密度脂蛋白的胶体金试纸条的生产方法1、单克隆抗体的制备用OXLDL(购自北京协和三友科技开发公司)免疫小白鼠，取免疫小鼠的脾细胞与小白鼠骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细胞，筛选能够稳定分泌OXLDL单克隆抗体的细胞株制备抗OXLDL的单克隆抗体1、2，1、2是针对抗原上不同的抗原决定簇，因此不会彼此结合，并测定单抗的效价。2、胶体金标记单克隆抗体1的方法胶体金与OXLDL单克隆抗体1按一定比例混匀，使胶体金与抗体形成单克隆抗体1-胶体金标记物。选择OXLDL单克隆抗体1作为金标记抗体，使用柠檬酸钠还原法制备并测定其最适标记纳米金颗粒大小为10nm，7300rpm/min转速离心25分钟，制备储液。将10nm胶体金和标记单抗进行蛋白最适量测定，pH9.0硼酸盐缓冲液将标记单抗作5～50ug/ml的梯度，加入金储液后再加入10％NaCl作稳定实验，5分钟后离心静止测OD580nm，得光密度稳定时得蛋白浓度为12ug/ml。制备好后，加入PEG做成胶体金稳定液。3、将金标物喷涂在结合垫上用聚乙二醇洗涤胶体金复合物，离心除去上清液，得深红色沉淀。纯化后的沉淀(即OXLDL单克隆抗体1-胶体金标记物)用缓冲液溶解，将标记好的金标抗体用1cm宽1.5cm长0.08cm厚度的无菌吸水海绵吸附做成胶体金标记物垫，真空抽干。4、硝酸纤维素膜的包被用纯化后制备成精确浓度的OXLDL单克隆抗体2溶液用特制的喷涂设备于硝酸纤维素膜上画线，线的宽度为1～1.5mm，包被好的硝酸纤维素膜用10％BSA溶液喷涂进行封闭。制取选取0.22um的无菌硝酸纤维素薄膜，裁剪成1cm宽，5cm长的矩形条，中间作0.8～1mm窄缝，要求平行于膜侧边，缝距两边等距，缝长10～15mm。检测区条带距膜探样端2.2cm，处于窄缝中间位置。检测带喷涂6ug/ml的OXLDL单克隆抗体2，半定量质控带涂0.6ug/ml的OXLDL，两条带长0.2cm，宽0.05cm。4℃黑暗环境，CO2缓慢吹干。5、试纸条的装配试纸条由样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫和PVC背衬组成。分为4个部分探样区，标记物结合区，对比检测区，吸水区。对比检测区中间有一纵向的狭缝，分为左边的测试区和平行参比区，用胶体金标记OXLDL单克隆抗体1，包被于标记物结合区，OXLDL单克隆抗体2包被于测试区的检测带上，一定量的氧化低密度脂蛋白包被于平行参比区的半定量对比条带上，兼作指控带。该试纸条利用免疫层析技术和双抗夹心法原理，通过测试区与平行参比区颜色对比的强弱来判定检测的半定量结果，可迅速判定样品中待测抗原的有无及其含量高低。颜色对比越强，则样品中OXLDL浓度越高，患病可能性越大，病变程度越深。从而对动脉粥样硬化性心血管病(ASCVD)进行早期辅助诊断。裁剪同硝酸纤维膜宽度的洁净PVC塑料板，要求在吸水端多2cm作为检测用手柄，在对应硝酸纤维膜探样区外多延伸1.2cm用强力双面胶将处理好的硝酸纤维素膜固定在PVC板上。硝酸纤维素膜吸水区用固定等宽1.5cm长0.25cm厚度的无菌吸水海绵。探样区固定1cm长等宽高级滤纸，距固定硝酸纤维膜0.2cm。中间用制备好的金标记物垫按Z型方式压在滤纸和硝酸纤维膜下面，搭在硝酸纤维膜上面的用胶贴牢，整个过程要求避免其它蛋白的沾染，即制备成了半定量检测氧化低密度脂蛋白的试纸条，铝箔袋密封4℃度干燥保存备用。实施例二胶体金试纸条的使用方法1、采样于晨起7～10时空腹抽前臂血，立即加入抗氧化剂，以防低密度脂蛋白在体外继续氧化，离心后取血浆置-30℃备检OXLDL。2、检测在检测前将试纸连包装拿出，室温放置5分钟左右。取出试纸，将探样区浸于样品溶液中，样品为血浆，液面不要过探样区。2-5秒后拿出，水平放置在干净操作台上。6～10分钟内即可肉眼见到结果。如果检测带没有看到红色而半定量带看见红色说明检测结果呈阴性，待测样品没有检出可以怀疑病患的氧化低密度脂蛋白，试纸条装置质量完好(如附图2中示意图1所示)；如果样品检测带和半定量带均出现红色，证明检测阳性。检测带颜色高于半定量带表明样品中存在的氧化低密度脂蛋白高于0.6ug/ml水平，表示患病(如附图2中示意图2所示)；颜色差异不大则样品中存在的氧化低密度脂蛋白接近于0.6ug/ml的临界水平，可能患病；如果检测带颜色低于半定量带则表面样品中存在的氧化低密度脂蛋白低于0.6ug/ml水平，表示正常(如附图2中示意图3所示)；如果检测带没有看到红色而半定量带也没有看见红色说明试纸条装置失效，已经不能用于检测。权利要求1.一种氧化低密度脂蛋白(OXLDL)快速半定量检测胶体金试纸条，该试纸条分为4个部分，包括了探样区，标记物结合区，对比检测区，吸水区，采用双单抗夹心模式检测，其特征在于胶体金标记OXLDL单克隆抗体1作为检测流动相，固定OXLDL单克隆抗体2作为固定相，半定量质控条带为能与金标单克隆抗体1特异结合并规定0.6ug/ml的OXLDL。2.根据权利要求1所述的OXLDL单克隆抗体1和OXLDL单克隆抗体2，其特征在于OXLDL单克隆抗体1和OXLDL单克隆抗体2为分别针对OXLDL的不同抗原决定簇。3.根据权利要求1所述的OXLDL单克隆抗体1和OXLDL单克隆抗体2，其特征在于OXLDL单克隆抗体1和OXLDL单克隆抗体2均为采用小鼠杂交瘤细胞法制备。4.根据权利要求1所述的一种氧化低密度脂蛋白快速半定量检测胶体金试纸条，其特征在于该试纸条用于检测血浆样品。5.根据权利要求1所述的一种氧化低密度脂蛋白快速半定量检测胶体金试纸条，其特征在于该试纸条可在动脉粥样硬化性心血管病(ASCVD)早期辅助诊断中的应用。全文摘要本发明提供一种快速、简便、敏感、经济、特异的、不需要特定仪器设备辅助的氧化低密度脂蛋白金标快速诊断试纸条，并能根据氧化低密度脂蛋白抗体捕获抗原的量建立颜色对浓度关系，迅速判定人血浆中OXLDL定性及半定量检测结果(高于或等于或低于标准对比氧化低密度脂蛋白样品的浓度)，实现对动脉粥样硬化性心血管病(ASCVD)的早期辅助诊断，同时提供该试纸的制作和装配方法。文档编号G01N33/544GK1896740SQ20051020039公开日2007年1月17日申请日期2005年7月15日优先权日2005年7月15日发明者李红玉,孙莺,张波,支德娟申请人:兰州大学