一种检测子宫内膜异位症的方法和试剂盒的制作方法

专利名称：：一种检测子宫内膜异位症的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测子宫内膜异位症的方法和试剂盒，属于医学检验领域。技术背景子宫内膜异位症(Edometriosis，EM)是子宫内膜组织异位在子宫腔以外并且引起病变，是一种常见病、多发病，引起盆腔疼痛、性交痛及不孕等，严重影响妇女的身心健康。发病率在15%-20%，在不孕妇女中占30%-50%。其发病机制尚不完全清楚，有诸多学说如子宫内膜种植学说、免疫学说、淋巴及静脉播散学说、体腔上皮化生学说等，但均不能完全解释内异症的发病。基础研究表明，血管形成和免疫学的异常在EM的病理发生中发挥重要的作用。沙桂华等的研究表明，与非EM来源的微血管内皮细胞相比，EM患者在位内膜来源的微血管内皮细胞在体外分离培养的过程中表现出了明显增强的存活能力。分子水平的研究显示，与非EM正常对照的在位内膜相比，Gremlin1(GREM1，GenbankAF110137)在这种细胞中的表达明显增强。GREM1是骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)的拮抗剂家族成员之一，是一含有184个氨基酸残基的分泌型蛋白质，分子量为20697Da，在生物进化过程中具有高度的保守性，在人和大鼠、小鼠、鸡及爪哇属之间其氨基酸序列高度同源。它能与特定的BMPs成员结合(尤其是BMP-2、-4、-7)，形成异二聚体，抑制BMPs与其受体结合，产生拮抗作用。它既存在于细胞内质网和高尔基体管腔中，也存在于细胞表面，以非共价键形式与细胞膜相连。有糖基化和非糖基化两种形式，二者均能拮抗BMPs的活性。GREM1主要在胚胎期的组织器官中表达，能够调节肢体的生长，抑制软骨发生和细胞的凋亡，对四肢、神经、肾、肺、皮肤、羽毛、耳等组织器官的发育起着重要的作用。它也存在于成年期的人和动物组织中，人体多种组织中也有gennlin的表达,在小肠、结肠及胚胎脑中有高表达，在成人脑、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌中弱表达。对成年人疾病的研究中，认为GREM1与糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、青光眼、肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化，甚至肿瘤的发生都有密切关系。在这些纤维化疾病中GREM1与促进上皮-间充质转化，抑制上皮细胞再生有关。在妇产科领域的研究主要集中于，它在卵巢中由卵母细胞和颗粒细胞表达，通过旁分泌的作用调节性激素产生。子宫内膜组织中有无GREM1的表达，与子宫内膜异位症有无关系国内外尚未有相关的报道。鉴于上述对内异症发病的新认识，本发明选择与促新生血管形成有关的蛋白GREM1为研究对象，首次揭示了该蛋白与内异症的关系，并成功开发出了检测子宫内膜异位症的方法和试剂。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种检测子宫内膜异位症的方法。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种用于检测子宫内膜异位症的酶联免疫吸附测定试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种检测子宫内膜异位症的方法，测定受试者在位子宫内膜组织或血清中GREM1蛋白的表达水平，判断是否患有子宫内膜异位症。参考的检测指标外周血血清中蛋白含量》700ng/ml时，推测患有子宫内膜异位症。根据本领域的公知常识，获知了GREM1蛋白能够作为子宫内膜异位症的标记物，可采用多种方法检测其表达水平从而进行疾病的诊断。所述检测子宫内膜异位症的方法可以是WesternBlot法、化学发光法、酶联免疫法或PCR法(优选RT-PCR)，前三种方法在蛋白质水平检测GREM1蛋白的表达量的变化，PCR法可在基因水平进行检测。本发明采用蛋白质免疫印迹法(Westernblotanalysis),证明了促血管形成因子--GREM1蛋白在子宫内膜中有表达。进一歩比较了子宫内膜异位症(EM)患者的在位子宫内膜组织与非子宫内膜异位症患者的子宫内膜组织中表达水平的差异，结果显示GREM1蛋白在内膜异位症患者的在位子宫内膜组织中的表达量高于非内膜异位症患者的子宫内膜。我们对两组患者的在位子宫内膜组织的GREM1mRNA水平的研究结果，显示在EM患者的在位子宫内膜组织中GREM1RNA水平较non-EM患者明显增高(P0.05)，提示我们EM患者与non-EM患者的在位子宫内膜组织中GREM1RNA及蛋白水平的表达都是存在的，两组之间有明显差异，EM患者的在位子宫内膜组织中存在着更多的GREM1。将其中两名妇女的血清去除高丰度蛋白后进行免疫印迹，其中EM患者较non-EM患者的条带灰度值明显升高。这个结果为我们采用酶联免疫法检测疾病和开发酶联免疫检测试剂盒提供了依据。本发明优选酶联免疫法测定受试者血清中GREM1蛋白的表达水平，步骤如下1.包被用包被液0.02mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液将GREM1单克隆抗体稀释至蛋白质含量为11(Hig/ml，在聚苯乙烯板的每个反应孔中加100ul，置4。C过夜；次日弃去孔内溶液，用洗涤液PBST洗涤1~3次，拍干；2.封闭加入封闭液(5%脱脂奶)200ul，37'C封闭2小时，用洗涤缓冲液PBST洗涤13次，弃去孔内溶液，拍干；3.加样每孔加入50ul待检样品(未稀释的血清)和用0.5%脱脂奶稀释的终浓度为0.2ug/ml的GREM1多克隆抗体50ul，37T共同孵育30min，用洗涤缓冲液PBST洗涤35次，弃去孔内溶液，拍干；标准曲线每孔加入50ul标准品，浓度为Oppb、100卯b、200ppb、400ppb、800ppb和1200卯b，和用0.5%脱脂奶稀释的终浓度为0.2ug/ml的GREM1多克隆抗体50ul，37'C共同孵育30min，用洗涤缓冲液PBST洗涤3~5次，弃去孔内溶液，拍干；4.加酶标抗体每孔加入用0.5%脱脂奶1:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG100ul，37'C孵育30min后PBST洗涤5次，弃去孔内溶液，拍干；5.显色反应每孔加入TMB(四甲基联苯胺)使用液100ul，显色15min;6.终止反应每孔加入50ul2mol/LH2SO4终止反应；7.结果判定在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测定各反应孔的OD值；以不同浓度的标准品吸光度值为横坐标、GREM1浓度为纵坐标进行线性拟合，得线性回归方程，根据回归方程测定样品中蛋白含量。血清蛋白含量》700ng/ml时，推测患有子宫内膜异位症。本发明使用的抗体可以通过商业途径获得，也可以实验室制备。多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法为本领域公知技术。一种检测子宫内膜异位症的酶联免疫试剂盒，由以下试剂组成，28'C避光保存1.48或96孔聚苯乙烯板；2.GREM1小鼠单克隆抗体(謂026585掘7)，Abnova公司;3.GREM1兔多克隆抗体(sc-28873)，santacruz公司;4.酶标抗体辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，santacruz公司；5.GREM1标准品用PBS稀释，浓度为Oppb、100ppb、200ppb、400ppb、800卯b和1200ppb;(recombinantmouseGREM1，956-GR/CF)，R&D公司；6.包被液pH7.2、浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液PBS7.IO倍浓縮洗涤液PBST:pH7.4、浓度1.5mol/L，将KH2P040.2g、Na2HP0412H202.9g、NaCl8.0g、KC10.2g和TWeen-200.5ml溶于100ml蒸馏水使用前用水或去离子水IO倍稀释至终浓度为0.15mol/L;8.封闭液5%脱脂奶，将5g脱脂奶粉溶于100ml洗涤液PBST;9.抗体稀释液0.5%脱脂奶，将0.5g脱脂奶粉溶于100ml洗涤液PBST;10.底物显色液四甲基联苯胺(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，0.75%H20232jxl，pH5.5底物缓冲液10ml。其中底物缓冲液的组成是O.IM柠檬酸(19.2g/L)24.3ml，0.2MNa2HP04'12H20(71.7g/L)25.7ml和50ml蒸馏水;11.终止液2MH2S04，蒸馏水I78.3ml，逐滴加入浓硫酸(98X)21.7ml。本发明的优点本发明首次揭示了GREM1蛋白表达量与子宫内膜异位症的关系，从而提供了一种有效检测子宫内膜异位症的标记物。本发明检测子宫内膜异位症的方法和试剂盒，采用ELISA定量测定受试者血清中GREM1蛋白的含量，对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品，检测方法简便易行。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本发明公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为用westernblot检测在位子宫内膜组织(EM组与非EM组)中GREM1的结果。图2为GREM1蛋白在EM与非EM患者在位子宫内膜中相对表达量的对比。图3为westernblot检测血清中的GREM1结果。图4为1例EM患者与1例非EM患者血清GREM1相对表达量的对比。图5为WesternBlot检测GREM1蛋白标准品。图6为用双抗夹心间接酶联免疫法测定血清中GREM1蛋白的标准曲线。图7为EM组和非EM组血清中GREM1的浓度。图8为非EM组增殖期与EM组增殖期血清中gremlin含量的比较。具体实施方式实施例1:GREM1蛋白与子宫内膜异位症的相关性一.材料(一)实验对象1.组织标本共取材16例，均是在我院(北京协和医院)进行手术治疗的患者，手术证实是子宫内膜异位症患者10例、非子宫内膜异位症患者6例。EM组和非EM组患者的纳入标准为，育龄期月经规律，周期25-34天，无其它内分泌、免疫和代谢性疾病，手术前三个月内未接受激素治疗。取子宫内膜异位症患者的在位子宫内膜组织和非子宫内膜异位症患者的子宫内膜组织，放入液氮中保存。2.血液标本取1例子宫内膜异位症患者A(26岁，双侧巧囊)、l例非子宫内膜异位症患者(43岁，卵巢滤泡囊肿及单纯囊肿)的血清，两者均在本院妇产科经手术病理证实。术前取静脉血2ml，EDTA抗凝，3000rpm，IO分钟，取血清分装于Eppendorf离心管内，保存于-7(TC冰箱中。(二)实验材料1.主要试剂一抗GREM1小鼠单克隆抗体，Abnova公司(H00026585-M07),GREM1兔多克隆抗体，santacruz公司(sc-28873)，小鼠P-actinIgG，上海晶美生物技术有限公司二抗辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG,santacruz公司辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG，北京中杉生物技术有限公司GREM1的标准品，R&D公司(recombinantmouseGREM1，956-GR/CF)总蛋白提取试剂盒，北京普利莱基因技术有限公司去白蛋白禾卩IgGi式齐U盒，AmershamBiosciences公司BCAproteinassaykit,Pierce公司2.其他试剂TrisBase,promega甘氨酸，北京化学试剂公司SDS，sigmaAP，sigma脱脂奶粉，santacruzNaCl北京化学试剂公司甲醇，北京世纪红星化工有限责任公司无水乙醇，北京化学试剂公司TEMED，invitrogenTween20,ameresco牛血清白蛋白(BSA)，北京方润生物公司A、B显迹液，Santacruz公司显影粉，北京普利莱基因技术有限公司定影粉，北京普利莱基因技术有限公司3.设备仪器北京普利莱基因技术有限公司96孔板37'C孵育箱酶标仪，磁力搅拌器精密移液枪半干转膜仪，高速冷冻离心机，水浴箱，台式高速离心机，TS-1型脱色摇床电子天平，双恒电泳仪，双垂直电泳槽，Eppendoff，德国上海司乐仪器厂Eppendorf，德国AmershampharmaciabiotekEppendorf，德国北京东方晶美科学仪器有限公司上海安亭科学仪器厂江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司上海梅特勒-托利多仪器有限公司北京东方仪器厂北京市六一仪器厂汕头市粤华医疗器械厂有限公司X射线摄影暗匣，凝胶成像分析系统，syngene二.实验方法蛋白质免疫印迹法(Westernblotanalysis)实验方法参照《分子克隆实验指南》(第三版)相关章节和中国协和医科大学基础医学院分子生物学实验室的方法。(一)液体配制1.10%SDS:SDS10g，加蒸馏水至100ml，50。C水浴下溶解，室温保存。2.10%过硫酸胺(AP):AP0.1g加超纯水1.0ml，溶解后，-20!)保存。3.1.5mol/LTrisHC1(pH8.8)Tris(MW121.14)45.43g，加超纯水200ml，溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。4.0.5mol/LTrisHC1(pH6.8):Tris(MW121.14)15.14g，加超纯水200ml，溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。5.100mg/ml牛血清白蛋白(BSA):BSAO.lg，加超纯水lml，制作蛋白标准曲线时，用超纯水进行100倍稀释成lmg/ml，-20^保存。6.30%丙烯酰胺/亚甲丙烯酰胺丙烯酰胺29g，亚甲丙烯酰胺lg，加水60ml溶解后补水至100ml，滤纸过滤，避光4'C储藏。7.(5X)SDS上样缓冲液0.5mol/LTrisHC1(pH6.8)2.5ml，二硫叔糖醇(DTT，MW154.5)0.39g，SDS0.5g，溴酚蓝0.025g，甘油2.5ml，混匀后，分装于1.5ml离心管中，4t:保存。8.电泳液缓冲液(IX):Tris(MW121.14)3.03g，甘氨酸(MW75.07)18.77g，SDSlg,加蒸馏水至1000ml。9.转移缓冲液(IX):甘氨酸(MW75.07)2.9g，Tris(MW121.14)5.8g，SDS0.37g，甲醇100ml，加蒸馏水至1000ml。10.TBST缓冲液1mol/LTrisHC1(pH8.0)100ml，NaCl9g,Tween20lml，加蒸馏水至1000ml。11.封闭液脱脂奶粉5g，力BTBST100ml，4。C保存，不超过1周。12.显影液(IX):将显影液粉(北京普利莱生物技术公司)加入自来水(加热至50'C)500ml中溶化，避光密封4'C保存。13.定影液(IX):将定影液粉(北京普利莱生物技术公司)加入自来水(加热至50'C)500ml中溶化，避光密封室温保存。(二)实验步骤1.蛋白样品制备(1)组织样品制备采用普利莱公司提供的总蛋白提取试剂盒。分别取小块子宫内膜(共16份)约100mg，剪碎后加入lml裂解液，放入玻璃匀浆器内，在冰上手动匀浆15次；取0.5ml组织匀浆液转移至1.5ml离心管中，加入lml抽提试剂充分混匀，4。C静置10min，偶尔晃动；于4。C、10000rpm离心10mins后，溶液分为上下两相，两相中间为蛋白膜。吸出上下层的液体，得到蛋白膜；敞开干燥10min后，加入200ul的1%SDS溶解蛋白膜，离心3000rpm3min去除未溶解物。所得的蛋白样品于-7(TC保存。(2)血清样品制备采用AmershamBiosciences公司产的去白蛋白和IgG试剂盒，此法可去除血清中〉95%的白蛋白和〉90%的IgG。在2个1.5ml离心管中，分别加入EM患者1例及non-EM患者1例的血清各15ul，分别加入750ul树脂混悬液，室温充分混合至少30min，震荡速度约250bpm;剪去过滤柱的下端，并放入微离心管中，将充分混匀的混合物全部移入过滤柱中，盖上盖子;于4。C、10000rpm离心5min后，收集滤液，每份血清约得到300ul滤液，-7(TC保存。2.蛋白含量的测定(BCA法)(1)取O.lg牛血清白蛋白(BSA)溶解于lml蒸馏水中，得到100mg/ml牛血清白蛋白，将其IOO倍稀释成lmg/mlBSA。一20。C保存。(2)取7个1.5ml离心管，分别标记为Omg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ral、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml。(3)制备标准品按表1在各管中加入各种试剂。表l:测定样品蛋白浓度的标准曲线<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(4)样品以适当比例稀释后测浓度(提取了总蛋白后的组织蛋白液稀释20-40倍，经去除了白蛋白和IgG后的血清样品稀释20倍)。(5)在96孔板上，每份样品及标准品取25ul各加入200ulBCA工作液(工作液成分一A液B液(V/V)=50:1)。(6)混匀后，37。C孵育30min。冷却至室温后，在酶标仪上560nm测0D值，作出蛋白质浓度的光吸收值标准曲线，并在BSA标准曲线中确定待测样品的蛋白质浓度。3.SDS—PAGE电泳(1)两块玻璃板中间放入绝缘胶条后对齐卡紧，垂直卡在架子上准备灌胶。先用酒精试验有无漏胶，如无漏胶，倾倒出酒精，并用吸水纸吸干。(2)按表2配12%分离胶，最后加入TEMED,加入TEMED后立即摇匀灌胶。灌胶速度要快，避免气泡。加完分离胶后立即在胶上轻柔地加一层75%酒精，使胶面平整。(3)待分离胶充分凝固后(室温凝固约30min),弃去胶上层的酒精并用吸水纸将酒精吸干。(4)按表2配5X的浓縮胶，加入TEMED后立即摇匀后灌胶。将剩余空间灌满浓縮胶后，将Teflon梳子插入浓縮胶中。室温凝固15min。(5)待到浓縮胶凝固后，拆掉绝缘胶条，灌入电泳液，并注意排尽胶底部的气泡，电泳液没过凝胶顶层。拔出Teflon梳子。(6)测完蛋白含量后，制备上样的蛋白样品。每个孔上样的样品总蛋白量为100ug，加入5XSDS上样缓冲液至终浓度为1X,上样体积为25ul。保证各泳道总蛋白量及上样体积均一致。上样前将样品及预染蛋白marker于沸水中煮5min使蛋白变性。(7)上样每批组织蛋白样品同时跑三块胶，得到的三张膜分别与GREM1多克隆抗体、GREM1单克隆抗体以及内参e-actin孵育。(8)电泳浓縮胶恒压130V，约10min，分离胶恒压160V，约110min。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止。表2:SDS—PAGE电泳分离胶浓縮胶配方<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>为了加快凝胶，可以将AP和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍4.半干法转膜(1)转一张膜需准备6张滤纸和1张PVDF膜。PVDF膜在甲醇中浸15min后与滤纸、胶一起在电转移液中平衡10min。膜〉胶，避免两边的滤纸接触后引起短路。(2)剥胶在盛有电转移液的搪瓷盘里将玻璃板轻轻撬掉，将浓縮胶轻轻刮去，并按照需要大小切胶。(3)在半干电转仪上制作"三明治"。过程中如果出现气泡，用玻棒擀去其中的气泡。膜和胶的位置固定后不要再移动。(阴极面)已润湿的三张Whatman3M滤纸已润湿的SDS-PAGE凝胶已润湿的PVDF转印膜己润湿的三张Whatman3M滤纸(阳极面)(4)盖上半干电转仪的盖子，同时转两张膜及以上时，盖子上需放置重物。电转条件恒流，电流(mA)=膜的总面积(cnT2)*0.8;80mim。(5)电转完毕后可见所需分子量附近的预染蛋白marker已转在了膜上，在膜上剪角以标记正面。5.免疫反应(1)将转好的膜用TBST浸湿后，移至含有封闭液的密封的塑料袋中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。(2)将封闭好的膜放入密封的塑料袋中，一抗用封闭液稀释至适当浓度(GREM1小鼠单克隆抗体l:500稀释，GREM1兔多克隆抗体l:800稀释，小鼠多克隆0-actin抗体1:IOOO稀释)；排尽气泡；万向摇床上4°C过夜孵育或室温下孵育3h，用TBST在室温下脱色摇床上洗10min*3次。(3)同上方法孵育二抗，二抗用封闭液稀释至适当浓度(羊抗小鼠IgG1:1000稀释，羊抗兔IgG1:2000稀释)，室温下孵育1.5h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗10min*3次。6.化学发光、显影、定影(1)将膜略控干后平放于parafilm上，将SantaCruz的化学发光剂A和B两种试剂等体积混合后点在膜上；lmin后，将膜略控干，移至塑料袋中包好，放入X-光片夹中并固定位置。(2)在暗室中，红光源下取出X光片，剪裁适当大小；打开X光片夹，把X光片放在膜上，一旦放上，不能移动。(3)关上X光片夹，开始计时，孵育了GREM1多克隆抗体的膜曝光时间为lmin,孵育了GREM1单克隆抗体的膜和孵育了3-actin的膜曝光时间为2min;(4)曝光完成后，取出X光片，迅速浸入显影液中显影，显影时间约2min，待出现明显条带后，即刻终止显影。在清水中洗去显影液后，马上将X光片浸入定影液中，定影时间以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干胶片。7.凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标条带。将一抗为GREM1单克隆抗体得到的条带与e-actin的条带作比得到的灰度值进行比较。三.结果1.参见图l，EM患者的在位子宫内膜组织10例，non-EM患者的子宫内膜组织6例，EM患者及non-EM患者的血清各l例，采用GREMl单克隆抗体的蛋白免疫印迹结果得到一个条带，分子量为47KD;采用GREM1多克隆抗体的蛋白免疫印迹结果得到两个条带，分子量分别为47KD和60KD。2.参见图2，凝胶图象分析条带灰度值，将单克隆抗体所得的47KD处的GREM1条带与e-actin的条带灰度值作比值EM组GREM1条带与P-actin的条带灰度值的比值为1.92土0.41，non-EM组为O.89±0.26。两组数据有显著差异，P<0.05。3.参见图3，EM患者的血清l例与non-EM患者的血清l例WesternBlot所示GREMl蛋白表达比较，采用GREM1单克隆抗体的蛋白免疫印迹结果得到一个条带，分子量为47KD;采用GREM1多克隆抗体的蛋白免疫印迹结果得到两个条带，分子量分别为47KD和60KD。4.参见图4，EM患者l例与non-EM患者1例血清GREM1相对表达量的对比有显著差异。5.参见图5，REM1蛋白标准品WesternBlot结果分别用单克隆抗体、多克隆抗体作为一抗孵育，均得到分子量为20KD大小的条带，与GREM1标准品分子量大小一致，证明两种抗体均能与GREM1蛋白标准品发生抗原抗体反应。四.讨论采用GREM1单克隆抗体的蛋白免疫印迹结果都能且仅能得到一个条带，分子量为47KD;采用GREM1多克隆抗体的蛋白免疫印迹结果均能得到两个条带，分子量分别为47KD和60KD。采用两种抗体得到的分子量为47KD大小的条带是共同的。本实验用GREM1单克隆抗体与多克隆抗体均检测出分子量为47KD的条带，且用GREM1标准品上样进行westernblot的实验也证实了这两种抗体均可与GREM1蛋白标准品发生抗原抗体反应。因此，有理由认为分子量为47KD的条带为GREM1蛋白。五.结论促血管形成因子一GREM1蛋白在子宫内膜中有表达。它在内膜异位症患者的在位子宫内膜组织中的表达量高于非内膜异位症患者的子宫内膜。实施例2:建立双抗夹心间接ELISA法检测EM患者血清中GREM1水平一.材料(一)实验对象血液标本选取2007年1月至2007年4月在本院(协和医院)妇产科经手术证实为子宫内膜异位症患者和非子宫内膜异位症患者共37例，其中23例为EM组，年龄17-49岁。non-EM组14例，包括畸胎瘤、卵巢单纯囊肿、卵巢滤泡囊肿、浆液粘液混合性囊腺瘤，年龄20-48岁。EM组年龄34士8.449岁，non-EM组年龄31.78±6.782岁，两组年龄相比无统计学显著性差异，P>0.05。术前取静脉血2ml，EDTA抗凝，3000rpm,10分钟，取血清分装于Eppendorf离心管内，保存于-7(TC冰箱中。(二)、实验材料1.主要试剂GREM1小鼠单克隆抗体(H00026585-M07)，Abnova公司GREM1兔多克隆抗体(sc-28873)，santacruz公司辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，santacruz公司GREM1标准品(recombinantmouseGREM1，956-GR/CF)，R&D公司2.其他试剂Na2C0:,、NaHCO:,.肌PO,、Na2HP(V12H20、NaCl、KC1，北京化学试剂公司TWeen-20,ameresco脱月旨奶粉，santacruzBSA，北京方润生物公司柠檬酸，北京化学试剂公司TMB(四甲基联苯胺)，北京化学试剂公司浓硫酸(98%)(三)设备仪器酶联检测仪，BioTek公司，自动洗板机，BioTek公司。96孔聚苯乙烯微量测定板，深圳金灿华有限公司。37'C孵育箱精密移液枪，Eppendorf，Germany台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司二.实验方法(一)液体配制1.碳酸盐缓冲液CB(pH9.6，0.05M):Na2C0:i1.59g,NaHC0:！2.93g，加蒸馏水1000ml(4t保存)。2.磷酸盐缓冲液PBS(pH7.2，0.02mol/L):KH2P040.2g，Na2HP(V12H202.9g，加蒸馏水1000ml(4'C保存)。3.洗涤缓冲液PBST(pH7.4,0.15M):KH2P040.2g，Na2HP04*12H202.9g，NaCl8.0g，KC10.2g，TWeen-200.5ml，加蒸馏水1000ml(4'C保存)。4.封闭液脱脂奶粉5克，加PBST100ml。5.1%BSA:牛血清白蛋白(BSA)l克，加PBST100ml。6.抗体稀释液脱脂奶粉O.5克，加PBST100ml。7.底物缓冲液(pH5.5):0.1M柠檬酸(19.2g/L)24.3ml，0.2MNa2HP(V12H20(7L7g/L)25.7ml，加蒸馏水50ml(4。C保存)。8.TMB(四甲基联苯胺)使用液TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，底物缓冲液(PH5.5)10ml，0.75%H20232pl。9.终止液(2MH2S04):蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。(二)实验步骤1.双抗体夹心间接ELISA方法的建立(1)用GREMl单克隆抗体100ul包被96孔聚苯乙烯微量测定板，置4'C过夜。甩干液体PBST洗涤1次，拍干。(2)加入封闭液200ul，37'C封闭2小时，PBST洗涤1次，甩出液体拍干。(3)加入待检抗原50ul和GREMl多克隆抗体50ul，37。C共同孵育30min，PBST洗涤5次，甩出液体拍干。(4)再加入HRP-羊抗兔IgG100ul，37。C孵育30min后PBST洗漆5次，甩出液体拍干。(5)加入底物TMB100ul显色15min，用2mol/LH2S0450ul终止,测定在450nm的OD值。2.检测方法的条件优化(1)单克隆抗体IgG包被浓度单克隆抗体作1:100、1:500、1:1000、1:3000、1:5000、1:IOOOO稀释并包被聚苯乙烯板，每孔100ul，固定标准品浓度300ng/ml，多克隆抗体按l:1000稀释，HRP-羊抗兔IgG按1:3000稀释使用。(2)包被缓冲液的选择单克隆抗体作l:IOOO稀释，分别用碳酸盐缓冲液(pH9.6，0.05mol/L)，磷酸盐缓冲液(pH7.2，0.02mol/L)以及双蒸水作为包被缓冲液，每个包被条件下，做一个空白孔和一个浓度为100ng/ml的标准品孔。多克隆抗体按1:1000稀释，HRP-羊抗兔IgG按1:3000稀释使用。(3)多克隆抗体IgG反应浓度单克隆抗体用磷酸盐缓冲液(pH7.2，0.02mol/L)作l:IOOO稀释后包被，固定标准品浓度300ng/ml,多克隆抗体按l:500、1:1000、1:3000、1:5000、1:10000稀释进行反应，HRP-羊抗兔IgG按1:3000稀释使用。(4)最适反应时间的确定在同等条件下进行双抗夹心间接ELISA实验，分别取各歩骤反应时间为30、45、60min，测定300ng/ml的标准品孔的OD值。(5)封闭液及抗体稀释液的选择封闭液分别选择5%脱脂牛奶、1%BSA、5%脱脂牛奶+0.5%明胶三种，封闭时间为2小时。抗体稀释液分别选择脱脂牛奶浓度分别为5%、3%、1%、0.5%。每种条件下做一个空白孔和一个浓度为100ng/ml的标准品孔。(6)血清稀释倍数的确定取2名EM患者与2名非EM妇女的血清均按X1、X20、X100作稀释。单克隆抗体作l:1000稀释，磷酸盐缓冲液(pH7.2，0.02mol/L)作包被缓冲液，多克隆抗体按l:1000稀释，HRP-羊抗兔IgG按1:3000稀释使用。三、实验结果(一)双抗体夹心间接ELISA方法的最佳反应条件确定1.单克隆抗体IgG最佳包被浓度的确定如表3所示，在不同的单抗包被浓度情况下，固定其他反应条件，测标准品浓度300ng/ml的OD值。可见在单克隆抗体1:1000倍稀释时(lug/ml)OD值最高，包被效果最好。表3:不同的单抗包被浓度情况下的OD值<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>2.包被缓冲液的确定:如表4所示，在不同的包被环境下，其他反应条件一致，测空白孔及标准品孔的OD值。可见使用pH7.2，0.02mol/L的磷酸盐缓冲液时，空白孔OD值最小，与100ng/ml的标准品孔有明显差异。表4:选择不同包被缓冲液时的OD值<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3.多克隆抗体IgG最佳反应浓度的确定-如表5所示，标准品浓度为300ng/ml，加入不同浓度的多克隆抗体，固定其他反应条件时，可见在多克隆抗体l:IOOO倍稀释时(0.2ug/ml)OD值最高，检测效果最好。表5:加入不同的多抗浓度情况下的OD值<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>4.最适反应时间的确定取各步骤反应时间为30、45、60min，测定300ng/ml的标准品孔的OD值分别为0.765、0.771、0.693，差异不显著，因此选择30min作为各步骤的反应时间。5.封闭液及抗体稀释液的确定由表6可见，在封闭液为5%脱脂奶，抗体稀释液为0.5%脱脂奶时可保证空白孔本底低且与100ng/ml的标准品孔有最大差异。表6:封闭液及抗体稀释液的选择<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>6.血清稀释倍数的确定根据4份血清结果可见血清不稀释时，EM患者与non-EM患者的OD值差异最大，因此选择X1作为最适血清稀释度。表7:血清稀释倍数的选择<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>7.根据上述条件优化歩骤，确定了双抗夹心间接ELISA方法检测血清中GREMl的最适条件为(1)用GREMl单克隆抗体作为捕获抗体，包被ELISA板(浓度为1ug/ml)，4。C过夜，包被缓冲液为磷酸盐缓冲液(pH7.2，0.02mol/L);(2)每孔加5%脱脂奶封闭；(3)每孔加50ul待检样品(血清不稀释)和50ul的GREMl多克隆抗体(浓度为0.2ug/ml)共同孵育；(4)GREMl多克隆抗体与HRP-羊抗兔IgG(1:3000稀释)均用0.5%脱脂奶稀释；(5)除了封闭和加底物显色外，其余各步反应时间为30min。(二)患者血清中GREMl的检测结果1.制作标准曲线表8:标准曲线<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>以吸光度值为横坐标、GREMl浓度为纵坐标进行线性拟合，线性回归方程为y=416.49x，线性相关系数为0.9357。标准曲线参阅图6。2.检测血清中GREMl的水平，EM组及non-EM组血清中GREMl水平无差异检测22例EM患者和14例非EM患者(卵巢滤泡囊肿、卵巢单纯囊肿、卵管系膜囊肿、卵巢成熟囊性畸胎瘤)的血清。采用SSPS软件包(版本12.0)做数据统计分析。EM组血清GREM1蛋白含量为685.4±249.5ng/ml，非EM组为557.2±140.5ng/ml，EM组患者血清GREM1含量与非EM组血清GREM1含量无显著性差异(P=0.203)。结果参阅图7。表9:EM组及非EM组血清中GREM1的检测结果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>参加实验的EM组和非EM组总人数为37人，其中一例为腹壁型子宫内膜异位症，不在统计之内。3.非EM组增殖期与EM组增殖期血清中GREM1水平有显著性差异按取血时患者子宫内膜的周期时相，将EM组和非EM组又分别分为增殖期和分泌期，并进行两两之间的比较，非EM组增殖期与EM组增殖期之间有显著性差异，P<0.05。non-EM组中增殖期与分泌期之间无显著性差异，P=0.284。EM组中增殖期与分泌期之间无显著性差异，P=0.566。非EM组分泌期与EM组分泌期之间无显著性差异，P=0.537。结果参阅图8。表10:non-EM组增殖期与EM组增殖期血清中GREMl水平有显著性差异<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>参加实验的EM组和非EM组总人数为37人，其中内膜时相分类不明确的，非EM组2例，EM组4例，不在此统计之内。四.讨论实验中发现非EM组增殖期与EM组增殖期之间血清GREM1的水平有显著性差异，P<0.05。这一结果不难理解，在子宫内膜的增殖期，EM患者体内除了在位内膜，还有异位的内膜病灶也在进行着血管形成，高水平的GREM1可能在其中起着促进血管形成的作用。五.结论1.子宫内膜异位症患者和非子宫内膜异位症患者的血清中均可以检测得到GREM1。2.在增殖期子宫内膜异位症患者血清中的GREM1的水平显著高于非子宫内膜异位症患者。实施例3:—种检测子宫内膜异位症的试剂盒一.组成检测子宫内膜异位症的酶联免疫试剂盒，由以下试剂组成，28'C避光保存1.48或96孔聚苯乙烯板；2.GREM1小鼠单克隆抗体(膽026585-M07)，Abnova公司;3.GREM1兔多克隆抗体(sc-28873)，santacruz公司；4.酶标抗体辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，santacruz公司；5.GREM1标准品用PBS稀释，浓度为Oppb、100卯b、200ppb、400卯b、800ppb和1200卯b;(recombinantmouseGREM1，956-GR/CF)，R&D公司；6.包被液pH7.2、浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液PBS;7.10倍浓縮洗涤液PBST:pH7.4、浓度1.5mol/L，将KH2P040.2g、Na2HP04*12H202.9g、NaCl8.0g、KC10.2g禾口TWeen-200.5ml溶于100ml蒸馏水；使用前用水或去离子水IO倍稀释至终浓度为0.15mol/L;8.封闭液5%脱脂奶，将5g脱脂奶粉溶于100ml洗涤液PBST;9.抗体稀释液0.5%脱脂奶，将0.5g脱脂奶粉溶于100ml洗涤液PBST;10.底物显色液四甲基联苯胺10mg/5ml无水乙醇0.5ml，0.75%H2O232^1，pH5.5底物缓冲液10ml,其中底物缓冲液的组成是O.IM柠檬酸(19.2g/L)24.3ml，0.2MNa2HPO4'12H2O(71.7g/L)25.7ml和50ml蒸馏水;11.终止液2MH2S04，蒸馏水178.3ml,逐滴加入浓硫酸(98X)21.7ml。二.使用方法1.将试剂盒打开，在室温平衡30分钟；浓縮洗涤液用蒸馏水或去离子水10倍稀释；2.将板条固定于板架上，剩余的板条用不干胶密封并放入密封袋中保存；3.包被用包被液稀释GREM1单克隆抗体至蛋白质含量为110pg/ml,在聚苯乙烯板的每个反应孔中加lOOul，置4'C过夜；次日弃去孔内溶液，用洗涤液PBST洗涤1~3次，拍干；3.封闭每孔加入封闭液200ul，37'C封闭2小时，用洗涤缓冲液PBST洗涤1~3次，弃去孔内溶液，拍干；4.加样每孔分别加入50ul待检样品和用抗体稀释液稀释的终浓度为0.2ug/ml的GREM1多克隆抗体50ul;同时在空白孔内分别加入各浓度的标准品50ul和用抗体稀释液稀释的终浓度为0.2ug/ml的GREM1多克隆抗体50ul用于制标准曲线；37'C共同孵育30min，用洗涤缓冲液PBST洗涤35次，弃去孔内溶液，拍干；5.加酶标抗体每孔加入用抗体稀释液l:3000稀释的酶标抗体100ul，37'C孵育30min后PBST洗涤5次，弃去孔内溶液，拍干；5.显色反应每孔加入底物显色液100ul，显色15min;6.终止反应每孔加入终止液50ul，终止反应；7.结果判定混匀后用酶标仪450nm读数判定结果，以空白对照孔调零后测定各反应孔的OD值；以不同浓度的标准品吸光度值为横坐标、GREM1浓度为纵坐标进行线性拟合，得线性回归方程和标准曲线，根据回归方程或标准曲线计算样品中蛋白含量。当蛋白含量》700ng/ml时，推测患有子宫内膜异位症。三.注意事项本发明采用不经稀释的血清进行检测，用量为50pl。血清勿使用染菌、脂血或溶血样品。按照标准方法收集血清，室温保存样品不要超过8小时，若实验在8小时以后进行，需将样品保存在21(TC，如保存超过1周则保存在-2(TC。权利要求1.一种检测子宫内膜异位症的方法，其特征在于通过测定受试者子宫内膜组织或血清中GREM1蛋白的表达水平，判断是否患有子宫内膜异位症。2.根据权利要求1所述的一种检测子宫内膜异位症的方法，其特征在于所述判断标准为血清蛋白含量》700ng/ml时，推测为患有子宫内膜异位症。3.根据权利要求1所述的一种检测子宫内膜异位症的方法，其特征在于所述检测子宫内膜异位症的方法可以是WesternBlot法、化学发光法、酶联免疫法或PCR法。4.据权利要求3所述的一种检测子宫内膜异位症的方法，其特征在于所述方法为酶联免疫法，步骤如下(1)包被用包被液0.02mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液将GREM1单克隆抗体稀释至蛋白质含量为110貼/ml，在聚苯乙烯板的每个反应孔中加100ul，置4'C过夜；次日弃去孔内溶液，用洗涤液PBST洗涤1~3次，拍干；(2)封闭加入5%脱脂奶200ul，37。C封闭2小时，用洗涤缓冲液PBST洗涤13次，弃去孔内溶液，拍干；(3)加样每孔加入50ul待检样品和用0.5。/。脱脂奶稀释的终浓度为0.2ug/ml的GREM1多克隆抗体50ul，37'C共同孵育30min，用洗涤缓冲液PBST洗涤3~5次，弃去孔内溶液，拍干；标准曲线每孔加入50ul标准品，浓度为0ppb、100ppb、200ppb、400ppb、800ppb和1200ppb，和用0.5%脱脂奶稀释的终浓度为0.2ug/ml的GREM1多克隆抗体50ul，37。C共同孵育30min，用洗涤缓冲液PBST洗涤3~5次，弃去孔内溶液，拍干；(4)加酶标抗体每孔加入用0.5%脱脂奶l:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG100ul，37'C孵育30min后PBST洗涤5次，弃去孔内溶液，拍干；(5)显色反应每孔加入TMB(四甲基联苯胺)使用液100ul，显色15min;(6)终止反应每孔加入50ul2mol/LH2S04终止反应;(7)结果判定在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测定各反应孔的OD值；以不同浓度的标准品吸光度值为横坐标、GREM1浓度为纵坐标进行线性拟合，得线性回归方程，根据回归方程测定样品中蛋白含量。5.—种检测子宫内膜异位症的酶联免疫试剂盒，由以下试剂组成，28'C避光保存(1)48或96孔聚苯乙烯板；(2)GREM1单克隆抗体；(3)GREM1多克隆抗体；(4)酶标抗体；(5)GREM1标准品；(6)包被液pH7.2、浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液PBS;(7)10倍浓縮洗涤液PBST:pH7.4、浓度1.5mol/L，将KH2P040.2g、Na2HP0412H202.9g、NaCl8.0g、KC10.2g和TWeen-200.5ml溶于100ml蒸馏水；使用前用水或去离子水IO倍稀释至终浓度为0.15mol/L;(8)封闭液5%脱脂奶，将5g脱脂奶粉溶于100ml洗涤液PBST;(9)抗体稀释液0.5%脱脂奶，将0.5g脱脂奶粉溶于100ml洗涤液PBST;(10)底物显色液四甲基联苯胺10mg/5ml无水乙醇0.5ml，0.75%H20232pl，pH5.5底物缓冲液10ml,其中底物缓冲液的组成是O.IM柠檬酸(19.2g/L)24.3ml，0.2MNa2HP04*12H20(71.7g/L)25.7ml和50ml蒸馏水;(11)终止液2MH2S04，蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98X)21.7ml。6.根据权利要求5所述的一种检测子宫内膜异位症的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述(2)GREM1单克隆抗体为GREM1小鼠单克隆抗体，Abnova公司。7.根据权利要求5所述的一种检测子宫内膜异位症的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述(3)GREM1多克隆抗体为GREM1兔多克隆抗体，santacruz公司。8.根据权利要求5所述的一种检测子宫内膜异位症的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述(4)酶标抗体为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，santacruz公司。9.根据权利要求5所述的一种检测子宫内膜异位症的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述(5)GREM1标准品为recombinantmouseGREM1，R&D公司。10.根据权利要求5所述的一种检测子宫内膜异位症的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述(5)GREM1标准品的浓度为0ppb、100ppb、200ppb、400ppb、800ppb和1200卯b。全文摘要本发明公开了一种检测子宫内膜异位症的方法，属于医学检验领域。一种检测子宫内膜异位症的方法，通过测定受试者子宫内膜组织或血清中GREM1蛋白的表达水平，判断是否患有子宫内膜异位症。本发明的优点本发明首次揭示了GREM1蛋白表达量与子宫内膜异位症的关系，从而提供了一种有效检测子宫内膜异位症的标记物。本发明检测子宫内膜异位症的方法和试剂盒，采用ELISA定量测定受试者血清中GREM1蛋白的含量，对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时检测大批样品，检测方法简便易行。文档编号G01N33/50GK101334410SQ200710117960公开日2008年12月31日申请日期2007年6月26日优先权日2007年6月26日发明者沙桂华,郎景和申请人:沙桂华;郎景和