专利名称：Nat2基因扩增用引物对、含有其的nat2基因扩增用试剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于扩增NAT2基因的引物对、含有其的NAT2基因扩增用试剂及其用途。
背景技术：
N-乙酰基转移酶(NATs)是与利用N-结合将芳香族胺或杂环胺的芳胺代谢成无毒且稳定的物质的代谢途径有关的酶。其中，NATs亚型中的NAT2关系到异烟胼(INH)、磺胺二甲嘧啶、其它的磺胺类、普鲁卡因胺、胼酞嗪、咖啡因、氨苯砜等同素环和杂环芳胺、胼样药物的解毒过程及2-氨基芴、4-氨基联苯、联苯胺、β -萘胺、蛋白质的热分解物质中存在的杂环芳胺等表达性生理物质、环境物质等的活化。已知ΝΑΤ2显示多态性，在人体中有 19种多态性。这些多态性中，ΝΑΤ2*5类(ΝΑΤ2*5Α 5D)为ΝΑΤ2基因的mRNA中的341位的T (胸腺嘧啶)突变成C (胞嘧啶)的多态性，NAT2*6类(NAT2*6A、NAT2*6B)为上述mRNA 中的590位的G(鸟嘌呤)突变成A (腺嘌呤)的多态性，NAT2*7类(NAT2*7A、NAT2*7B)为 mRNA中的857位的G (鸟嘌呤)突变成A (腺嘌呤)的多态性。已知具有这些突变的患者在服用作为抗拮抗剂的INH时，会发生肝功能损伤。其原因在于，由于NAT2基因突变，NAT2活性改变，由此无法充分地进行INH的N-乙酰化，肝毒性高的胼的产生增多。另外，还已知NAT2的基因多态性与上述普鲁卡因胺或柳氮磺胺吡啶等的副作用有关。因此，确认患者NAT2基因多态性在回避副作用、进行适当药物治疗时极为重要。特别是，对于NAT2而言，重要的是确认多个多态性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)。另外，作为在基因水平解析所有疾病的原因、个体间的疾病易感性(易患疾病)、 个体间的药效不同等的方法，广泛地进行点突变、所谓的单核苷酸多态性(SNP)的检测。点突变的通常检测方法可以举出(1)对于试样的目标DNA利用PCR(聚合物酶链反应)将相当于检测对象序列的区域扩增、对其全基因序列进行解析的直接测序法；(2)对于试样的目标DNA，利用PCR将相当于检测对象序列的区域扩增，通过随着上述检测对象序列中有无目标突变而剪切作用不同的限制酶将该扩增产物切断，进行电泳从而进行分型的RFLP解析； (3)使用目标突变位于3’末端区域的引物进行PCR，通过有无扩增来判断突变的ASP-PCR 法等。但是，这些方法例如必须进行由试样提取的DNA的精制、电泳、限制酶处理等，因此需要功夫和成本。另外，进行PCR后，有必要暂时开启反应容器，因此有上述扩增产物混入到之后的反应体系内，解析精度降低的顾虑。而且，由于自动化困难，因此无法解析大量的样品。另外，对于上述(3)的A SP-PCR法，还存在特异性低的问题。
由该问题出发，近年来作为点突变的检测方法，正在实施对由目标核酸和探针形成的双链核酸的融解温度(Tm)进行解析的方法。这种方法由于通过例如Tm解析或上述双链的融解曲线的解析来进行，因此称作融解曲线解析。其为以下的方法。即，首先使用与含有检测目标的点突变的检测对象序列互补的探针，使检测试样中的目标单链DNA与上述探针形成杂交体(双链DNA)。接着，对该杂交产物实施加热处理，通过吸光度等信号的变动来检测伴随温度上升的杂交体的解离(融解)。然后，根据该检测结果确定Tm值，从而判断有无点突变。在杂交产物的同源性越高时Tm值越高、同源性越低时Tm值越低。因此，对于含有点突变的检测对象序列和与其互补的探针的杂交产物，预先求得Tm值(评价标准值)， 再测定检测试样的目标单链DNA和上述探针的Tm值(测定值)。上述测定值与评价标准值相同时，则可以判断为匹配、即目标DNA中存在点突变，测定值低于评价标准值时，则可以判断为不匹配、即在目标DNA上不存在点突变。而且，通过该方法还可以使基因解析自动化。但是，对于这种利用Tm解析的检测方法来说存在如下的问题在PCR中必需特异且高效地扩增含有检测目标位点的区域。特别是由于NAT存在多个同工酶、编码它们的序列也极为相似，因此在PCR中，有NAT2以外的同工酶的编码基因也被扩增的顾虑。另外，当其它同工酶的编码基因也被扩增的情况下，也成为例如在NAT2基因的特定多态性 (NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)的解析(非专利文献1或非专利文献幻中解析结果的可靠性降低的原因。而且，如此由于解析1个样品也需要大量的劳力，因此还具有解析大量样品方面并不实用的问题。非专利文献1 =PMID :8102908Jpn J Hum Genet. 1993Jun ；38 (2) :163-8.非专利文献2 =PMID :10507782Br J Cancer. 19990 ct ；81 (3) :537-41.
发明内容
因此，本发明的目的在于提供用于利用基因扩增法特异扩增NAT2基因的目标区域的引物对。为了达成上述目的，本发明的引物对，其特征在于，是用于利用基因扩增法扩增 NAT2基因的引物对，含有选自由下述引物对(1) (3)所组成的组中的至少一对引物对。引物对(1)含有包含下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对(Fl)与序列号1的碱基序列中的、以第1038位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向5’方向至第20 32个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述鸟嘌呤碱基(G)为3’末端，(Rl)与序列号1的碱基序列中的、以第1096位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第17 M个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第 1096位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端；引物对O)含有包含下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对
(F2)与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第20 38个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)为3’末端，(R2)下述寡核苷酸中的至少一个与序列号1的碱基序列中的、以第1355位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向3’ 方向至第25 40个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1355位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)为3’末端，以及与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’ 方向至第21 36个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1614位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端；引物对(3)含有包含下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对(F3)下述寡核苷酸中的至少一个与序列号1的碱基序列中的、以第1556位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基朝向 5’方向至第21 40个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胸腺嘧啶碱基⑴为3’末端，以及与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’ 方向至第20 38个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)为3’末端，(R3)与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第21 36个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第 1614位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端。另外，本发明的基因扩增用试剂其特征在于，是用于利用基因扩增法扩增NAT2基因的试剂，其含有上述本发明的NAT2基因扩增用引物对。本发明的扩增产物的制造方法，其特征在于，其为利用基因扩增法制造NAT2基因的扩增产物的方法，包含下述(I)工序(I)以试样中的核酸作为模板，使用本发明的NAT2基因扩增用引物对，在反应液中扩增上述NAT2基因的工序。本发明的多态性解析方法，其特征在于，其为解析NAT2中3个检测对象位点的多态性的方法，包括下述(i) (iv)工序(i)利用本发明的扩增产物的制造方法，在反应液中扩增NAT2基因中的含有检测对象位点的区域的工序，(ii)准备含有上述(i)工序的扩增产物和能够与上述检测对象位点杂交的探针的反应液的工序，(iii)改变上述反应液的温度，测定上述扩增产物与上述探针的杂交产物显示融解状态的信号值的工序，
(iv)由伴随温度变化的上述信号值的变动，确定上述检测对象位点的多态性的工序。利用本发明的引物对，可以在反应液中特异且高效地扩增NAT2基因中的、含有检测目标多态性(NAT2*5或NAT2*6、NAT2*7)发生位点的目标区域。因此，与上述的现有方法不同，可以减少功夫和成本。另外，由于如此特异地扩增NAT2基因的含有特定多态性发生的检测对象位点的区域，因此通过进一步使用与检测对象序列互补的探针，可以使用上述反应液直接进行Tm解析，将上述多态性分型。另外，由于可以在一个反应液中进行扩增、分型，因此还能够实现操作的自动化。而且，当使用本发明的引物对时，例如即便是含有杂质的试样(例如全血或口腔粘膜等)，由于可以省略预处理，因此可以更为迅速且简单地进行扩增反应。另外，当使用本发明的引物对时，由于以优于以往的扩增效率进行扩增反应，因此还能够缩短扩增反应。因而，利用本发明的引物对、含有其的试剂、以及使用它们的扩增产物的制造方法和多态性解析方法，由于可以迅速且简单地解析NAT2基因的多态性，因此在医疗领域中极为有效。
图1为表示本发明实施例1的Tm解析结果的图表。图2为表示本发明实施例2的Tm解析结果的图表。
具体实施例方式<NAT2基因扩增用引物对>本发明的NAT2基因扩增用引物对如上所述，其特征在于，含有选自由上述引物对
(1) C3)所组成的组中的至少一对引物对。通过含有至少任一对引物对，例如可以特异地扩增NAT2基因中的特定目标区域。本发明的NAT2基因扩增用引物对例如可以仅含有上述引物对⑴ (3)中的任一种，还可以含有任两种或者含有引物对⑴ (3)的全部。在后叙述，利用引物对⑴能够特异扩增的目标区域为在NAT2基因中含有多态性NAT2*5发生位点的区域，利用引物对
(2)能够特异扩增的目标区域为在NAT2基因中含有多态性NAT2*6发生位点的区域，利用引物对(3)能够特异扩增的目标区域为在NAT2区域中含有多态性NAT2*7发生位点的区域。如上所述，已知NAT2基因的这3种多态性全部为对药物代谢具有影响的多态性， 因此重要的是不仅对任1种进行研究，还要对任2种或者3种全部进行研究。但是，以往方法具有无法在一个反应体系内解析多个序列的问题。这是由于如上所述NAT存在多个同工酶，因此在PCR中，连NAT2以外的同工酶的编码基因也被扩增。因而，为了研究NAT2基因的3种多态性(NAT2*5、NAT2*6和NAT2*7)中的2种或3种全部多态性，有必要在各反应体系中分别扩增含有各个多态性发生位点的区域，对所得扩增产物分别进行解析。如此，以往的方法难以做到仅将NAT基因中的NAT2基因作为模板、且在NAT2基因中仅特异地扩增分别含有上述多态性发生位点的2种或3种目标区域。而且，由于解析1个样品也需要大量劳力，因此具有解析大量样品并不实用的问题。与此相反，通过本发明的NAT2基因扩增用引物对，在含有上述引物对(1) (3)中的任2种或3种全部时，可以在同一反应液中同时且特异地扩增各个目标区域。因此，与上述以往方法不同，可以减少功夫和成本。另外，由于在同一反应液中特异地扩增2个或3个目标区域，因此例如通过使用与各个目标区域的检测对象序列互补的探针，可以使用上述反应液直接进行Tm解析，分别对上述2种或3种多态性进行分型。如此，由于可以在同一反应液中解析NAT2基因中的2种或3种多态性， 因此本发明的NAT2基因扩增用引物对例如在含有引物对(1) (3)任一种时当然优选，在含有任2种或3种时也优选。使用这种NAT2基因扩增用引物对，扩增1个目标区域当然是可以的，当同时扩增2个或3个目标区域时，也可以较以往更为高效地进行NAT2基因的多态性解析。予以说明，以下有时将正向引物称作F引物、将反向引物称作R引物。上述引物对(1)如上所述，为含有包含下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对。(Fl)与序列号1的碱基序列中的、以第1038位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向5’方向至第20 32个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述鸟嘌呤碱基(G)为3’末端，(Rl)与序列号1的碱基序列中的、以第1096位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第17 M个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第 1096位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端。序列号1所示的碱基序列是人来源的芳胺N-乙酰基转移酶NAT等位基因1-2基 13 (Human h NAT allele l~2gene forarylamine N-acetyltransferase) StJ DNA !ψβ], M 如NCBI登录号No. D10870所登录的基因。上述引物对(1)为用于扩增序列号1中的、含有第1039 第1095区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内的第1063位碱基(序列号1的第1063位碱基)存在对NAT2的功能具有影响的点突变(1063T、1063C)，该多态性为上述NAT2*5。本发明中，该位点的多态性在为纯合子时用1063T/T、1063C/C表示，在为杂合子时用1063T/C表示。予以说明，序列号1中的第1063位碱基相当于NAT2基因的mRNA的第341位碱基，因此NAT2*5 的多态性还可以表示为;341T/T、341C/C、341T/C。以下，将该引物对(1)称作“NAT2*5用引物对”。予以说明，在仅解析NAT2*5的多态性时，可以仅使用NAT2*5用引物对。弓丨物对(1)的Fl引物和Rl引物，只要是起到决定DNA聚合酶扩增的起始点的作用的3’末端碱基满足上述条件即可。如此，通过固定各引物的3’末端的碱基，可以充分地防止引物对(1)例如结合在类似的其它同工酶基因(例如NATl、NAT6、NAT8、NAT9基因等) 上。这样，Fl引物和Rl引物由于只要其3’末端的碱基被固定即可，因此各引物的长度本身并无特别限定，可以适当调整至普通的长度。作为引物长度的一例，例如为13 50mer 的范围、优选为14 45mer、更优选为15 40mer。作为具体例，上述Fl引物优选为如下 与序列号1的碱基序列中的、以第1038位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向5’方向至第 20 32个碱基(优选第M 30个碱基、更优选第25 四个碱基)的区域序列相同的至少一个寡核苷酸。另外，上述Rl引物优选如下与序列号1的碱基序列中的、以第1096位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第17 M个碱基(优选第19 23个碱基、更优选第20 22个碱基)的区域互补的至少一个寡核苷酸。予以说明，由于Fl引物和Rl引物的3’末端被固定，因此由引物延伸的区域例如如上所述为序列号1的第1039 第1095的区域，所得扩增产物的整个长度随所用引物的长度而改变。另外，Rl引物可以是与序列号1所示的碱基序列并非完全互补的寡核苷酸、Fl引物可以是与上述碱基序列的互补链并非完全互补的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端碱基以外的部分中，可以与完全互补的寡核苷酸有1个 5个碱基不同。以下举出Fl引物和Rl引物的具体例子，本发明并非限于此。另外，这些Fl弓丨物和Rl引物的组合并无任何限定，这些中，特别优选含有包含序列号5或序列号7的寡核苷酸的F1’引物和包含序列号16或序列号18的寡核苷酸的R1’引物的引物对(1’)。予以说明，下述表的“Tm(°C)”是下述表的序列和与其完全互补的序列杂交时的Tm(°C)，通过MELTCALC软件(http://WWW. meltcalc. com)、将参数设为寡核苷酸浓度0. 2 μ M、钠当量 (Na eq.)50mM而计算的数值(以下相同)。上述Tm值例如可通过现有公知的MELTCALC 软件(http://www.meltcalc.com)等计算，另外，还可以通过邻接法(Nearest Neighbor Method)确定(以下相同)。表 1
引物序歹丨.Tm(0C)序列号F1引物 NAT2*5用5'-ccctccagttaacaaatacagcactggcatgg-3'6425'-cctccagttaacaaatacagcactggcatgg-3'62.735'-ctccagttaacaaatacagcactggcatgg-3'61.445'-tccagttaacaaatacagcactggcatgg-3'60.955'-ccagttaacaaatacagcactggcatgg-3'60.165'-cagttaacaaatacagcactggcatgg-3'58.675'-agttaacaaatacagcactggcatgg-3'57.785'-gttaacaaatacagcactggcatgg-3'56.8g5'-ttaacaaatacagcactggcatgg-3'55.8105'-taacaaatacagcactggcatgg-3'55.3115'-aacaaatacagcactggcatgg-3'55.6125'-acaaatacagcactggcatgg-3'55.2135'-caaatacagcactggcatgff-3'53.614R1引物 NAT2*5用5'-gccacatctgggaggagcttccag-3'62.5155'-ccacatctgggaggagcttccag-3'60.1165 '-cacatctgggaggagcttccag-3'58.2175'-acatctgggaggagcttccag-3'57.1185'-catctgggaggagcttccag-3'55.6195'-atctgggaggagcttccag-3'54.2205'-totgggaggagcttccag-3'53.8215·—ctgggaggagcttccag-3'52.222接着，上述引物对( 如上所述，为含有包含下述(F》的寡核苷酸的正向引物和包含下述(似)的寡核苷酸的反相引物的一对引物对。(F2)与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第20 38个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)为3’末端，(R2)下述寡核苷酸中的至少一个与序列号1的碱基序列中的、以第1355位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向3’ 方向至第25 40个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1355位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)为3’末端，以及与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’ 方向至第21 36个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1614位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端。上述引物对⑵为用于扩增序列号1中的、含有第1279 第13M区域或第 1279 第1613区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内的第1312位碱基(序列号1的第1312位碱基)存在对NAT2的功能具有影响的点突变(1312G、1312A)，该多态性为上述NAT2*6。本发明中，该位点的多态性在为纯合子时可用1312G/G、1312A/A表示，在为杂合子时可用1312G/A表示。予以说明，序列号1中的第1312位碱基相当于NAT2基因的 mRNA中的第590位碱基，因此NAT2*6的多态性，例如还可以表示为590G/G、590A/A、590G/ Α。以下，将该引物对(2)称作“NAT2*6用引物对”。予以说明，在仅解析NAT2*6的多态性时，可以仅使用NAT2*6用引物对。本发明中，从与上述引物对(1)相同的理由出发，引物对O)的F2引物和R2引物只要是起到决定DNA聚合酶的扩增起始点的作用的3’末端的碱基满足上述条件即可。因此，F2引物和R2引物的长度本身并无特别限定，可以举出与上述同样的长度。作为具体例， 上述F2引物优选如下与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第 1碱基朝向5’方向至第20 38个碱基(优选第21 38个碱基、更优选第22 38个碱基)的区域序列相同的至少一个寡核苷酸。另外，上述(R2)引物优选如下与序列号1的碱基序列中的、以第1355位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向3’方向至第25 40个碱基(优选第27 35个碱基、更优选第观 34个碱基)的区域互补的至少一个寡核苷酸或者与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’ 方向至第21 36个碱基(优选第23 36个碱基、更优选第M 36个碱基)的区域互补的至少一个寡核苷酸。予以说明，由于F2引物和R2引物的3’末端被固定，因此由引物延伸的区域通常为序列号1的第1279 第13M区域或第1279 第1613区域，所得扩增产物的整个长度随所用引物的长度改变。另外，R2引物可以是与序列号1所示的碱基序列并非完全互补的寡核苷酸、F2引物可以是与上述碱基序列的互补链并非完全互补的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端的碱基外的部分，可以与完全互补的寡核苷酸有1个 5个碱基不同。以下举出F2引物和R2引物的具体例子，本发明并非限于此。另外，这些F2弓丨物和R2引物的组合并无任何限定，这些中，特别优选含有包含序列号33或序列号109的寡核苷酸的F2’引物和包含序列号39或序列号48的寡核苷酸的R2’引物的引物对(2’ )。表 权利要求
1.一种探针，其特征在于，其为用于检测NAT2基因的多态性的探针， 其由下述(1)的寡核苷酸构成，(1)与序列号1中的、以第1056位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向3’方向至第 13 19个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基为3’末端。
2.根据权利要求1所述的探针，所述寡核苷酸(1)为序列号87 92和116 123中任一个寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的探针，所述寡核苷酸(1)为选自由序列号90的寡核苷酸、序列号91的寡核苷酸、序列号118的寡核苷酸以及序列号122的寡核苷酸组成组中的至少一个寡核苷酸。
4.根据权利要求1所述的探针，所述探针为荧光标记探针。
5.一种试剂，其特征在于，其为用于检测NAT2基因的多态性的试剂，其含有权利要求1 所述的探针。
6.根据权利要求5所述的试剂，其还包含由下述(2)的寡核苷酸构成的探针和由下述 (3)的寡核苷酸构成的探针，(2)与序列号1中的、以第1302位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第 18 27个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基为5’ 末端，(3)与序列号1中的、以第1583位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第 16 21个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基为3’ 末端。
7.根据权利要求6所述的探针，所述( 的寡核苷酸为序列号93 102中任一个寡核苷酸，所述(3)的寡核苷酸为序列号103 108中任一个寡核苷酸。
8.根据权利要求7所述的探针，所述(2)的寡核苷酸为由序列号99的碱基序列构成的寡核苷酸；所述⑶的寡核苷酸为选自由序列号105的碱基序列构成的寡核苷酸、以及由序列号107的碱基序列构成的寡核苷酸中的至少一个寡核苷酸。
9.根据权利要求5所述的试剂，所述探针为荧光标记探针。
10.一种多态性解析方法，其特征在于，其为解析NAT2基因的检测对象位点的多态性的方法，包括下述(i) (iv)工序(i)以试样中的核酸为模板，在反应液中扩增NAT2基因中含有检测对象位点的区域的工序，( )准备含有上述(i)工序的扩增产物和权利要求1所述的探针的反应液的工序，(iii)改变所述反应液的温度，测定所述扩增产物与所述试剂中的探针的杂交产物显示融解状态的信号值的工序，(iv)由伴随温度变化的所述信号值的变动，确定所述检测对象位点的多态性的工序。
11.根据权利要求10所述的多态性解析方法，其中，在所述(i)工序中，在扩增反应之前，向所述反应液中添加权利要求1所述的探针。
12.根据权利要求10所述的多态性解析方法，所述试样为生物体试样。
13.根据权利要求12所述的多态性解析方法，所述生物体试样为全血。
14.根据权利要求10所述的多态性解析方法，在所述(i)工序中，使用下述引物对 (1)，在反应液中进行所述NAT2的扩增，引物对⑴含有包含下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对(Fl)与序列号1的碱基序列中的、以第1038位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向 5’方向至第20 32个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述鸟嘌呤碱基(G)为3’末端，(Rl)与序列号1的碱基序列中的、以第1096位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向 3’方向至第17 M个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1096 位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端。
15.根据权利要求14所述的多态性解析方法，在所述(ii)工序中，所述反应液还含有由下述( 的寡核苷酸构成的探针，在所述(i) 工序中，还使用下述引物对0)，在反应液中进行所述NAT2的扩增，(2)与序列号1中的、以第1302位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第 18 27个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基为5’ 末端，引物对⑵含有包含下述(^)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(似)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对(F2)与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向 5’方向至第20 38个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)为3’末端，(R2):下述寡核苷酸中的至少一个与序列号1的碱基序列中的、以第1355位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向3’方向至第25 40个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1355位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)为3’末端，以及与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第21 36个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1614位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端。
16.根据权利要求14所述的多态性解析方法，在所述(ii)工序中，所述反应液还含有由下述C3)的寡核苷酸构成的探针，在所述(i) 工序中，还使用下述引物对(3)，在反应液中进行所述NAT2的扩增，(3)与序列号1中的、以第1583位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第 16 21个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基为3’ 末端，引物对⑶含有包含下述(F!3)的寡核苷酸的正向引物和包含下述0 )的寡核苷酸的反向引物的一对引物对(F3):下述寡核苷酸中的至少一个与序列号1的碱基序列中的、以第1556位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基朝向5’ 方向至第21 40个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胸腺嘧啶碱基⑴为3’末端，以及与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第20 38个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)为3，末端，(R3)与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向 3’方向至第21 36个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1614 位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端。
全文摘要
本发明提供一种引物对，其为用于利用基因扩增法扩增NAT2基因中的含有检测目标位点的目标区域的引物对，其能够特异地扩增上述区域。使用分别包含含有序列号7、序列号33和序列号60的碱基序列的正向引物和包含序列号18、序列号48和序列号81的碱基序列的反向引物的3对引物对。通过使用该引物对，可以在同一反应液中同时扩增NAT2基因的分别含有3种多态性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)发生位点的3个区域。
文档编号G01N21/64GK102154274SQ20111003464
公开日2011年8月17日 申请日期2007年11月30日 优先权日2006年11月30日
发明者平井光春, 间岛智史 申请人:爱科来株式会社