上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料的制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种水溶性叶酸功能化的上转换纳米粒子（FA-UCNPs）与氧化石墨烯（GO）的复合材料的制备方法，主要分为三个步骤：一是FA-UCNPs的制备，先合成二甘醇修饰的上转换纳米粒子（DEG-UCNPs）再合成FA-UCNPs；二是GO的制备，首先是将石墨薄片进行预氧化，然后再进行氧化，合成出水溶性良好、产率高且尺寸可调的GO；三是FA-UCNPs/GO的制备，将质量比为1/1-1/2的FA-UCNPs与GO分散在高纯水中，振荡10min，真空常温干燥，即得到FA-UCNPs/GO。将本发明所制备的FA-UCNPs/GO，水溶性、稳定性好且可用作生物探针来识别癌变细胞，因此在癌症的早期诊断中有很好的应用前景。
【专利说明】上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料的制备方法与应用
[0001]本专利受到国家自然科学基金面上项目21375095、全国优秀博士学位论文作者专项资助资金FANEDD-201023，天津市应用基础研究计划重点项目12JCZDJC21700，天津市高校“中青年骨干创新人才培养计划”ZX110GG015和天津师范大学“渤海学者”引进人才科研项目5RL098的资助。
【技术领域】
[0002]本发明属于荧光探针纳米材料制备领域，具体涉及一种水溶性叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯的复合材料及其制备方法，主要用于识别癌变细胞。
【背景技术】
[0003]稀土离子具有丰富的能级结构和优异的光学特性，近年来稀土掺杂的上转换纳米材料在生物分子标记和生物成像等领域显示出重要的应用前景。传统的下转换荧光材料(高能量短波激发、低能量长波发射)如有机染料和II 一VI族半导体量子点等在用于生物标记和疾病诊断方面还存在一些问题，例如:有机染料容易光漂白，发射谱太宽等，量子点本身有毒、化学稳定性差等，从而限制了其进一步发展。相反，近红外可见光上转换纳米材料在受到光激发时能吸收低能量的长波辐射，而发射出高能量的短波辐射，具有许多有机染料和半导体量子点不具备的优点，包括荧光寿命长而无闪烁、毒性低、荧光量子产率高、自体荧光小、化学稳定性和光稳定性好以及渗透深度大，从而引起了科研人员的广泛关注。
[0004]氧化石墨烯(GO)具有自由分散的二维结构和丰富的极性基团，使其在功能化复合材料方面展现出突出的优势，受到了科学界的广泛关注。由于片层内SP3区和SP2区的随机分布，GO表现出有奇特的电学和光学特性，被认为是功能化的石墨烯材料，具有重要的理论研究和应用价目前所有关于石墨烯复合材料的研究都处于起步阶段，机会与挑战并存。氧化石墨烯由于具有含氧基团，使它可以稳定地分散在水、乙二醇等极性溶剂中。羧基、羟基、环氧基等有诸多化学反应的可能，所以可以通过化学反应接枝各种纳米粒子或者生物大分子。基于此氧化石墨烯已经被广泛应用于众多领域。
[0005]近年来，复合材料应用于生物探针的报道越来越多，在此我们将叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯发生复合，他们由于静电作用吸附在一起，致使荧光淬灭。我们知道癌变细胞表面有很多叶酸受体，这些叶酸受体可以识别和转运叶酸到细胞内，即可以转运叶酸功能化的的上转换纳米粒子到癌变细胞内，在光源激发下，癌变细胞里发出荧光，而对于正常细胞则没有荧光，借此可以起到识别癌变细胞的作用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种工艺简单、粒径较小、尺寸均匀、成本低、水溶性和生物相溶性好、可识别癌变细胞的叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯的复合材料的制备方法。
[0007]为实现上述目的，本发明公开了一种叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料，其特征在于它是由质量比为1/1-1/2的叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯组成。
[0008]本发明进一步公开了水溶性叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行:
(1)水溶性叶酸功能化的上转换粒子的制备:
a)稀土硝化物的制备:将0.4mmol氧化乾Y203、0.09mmol氧化镱Yb203、0.01mmol氧化铒Er2O3,即乾、镱、铒物质的量之比Y/Yb/Er =80/18/2, Y+Yb+Er=lmmol,称好质量,放入50mL小烧杯中，加入1.5-3mL浓硝酸，4mL高纯水，在通风橱中100°C，硝化，蒸干；其中氧化钇Y2O3中Y的物质的量为0.8mmol、氧化镱Yb2O3中Yb的物质的量为0.18mmol、氧化铒Er2O3中Er的物质的量为0.02mmol ；
b)二甘醇修饰的上转换粒子的制备:称取4-16mmol的NaF，放于IOOmL圆底烧瓶中，加入IOmL 二甘醇+高纯水，在氮气保护、磁子搅拌下，用油浴加热到160-200° C，向步骤a)蒸干的小烧杯中加入12.5mL 二甘醇+高纯水，20° C加热，使硝化物溶解在二甘醇一高纯水溶剂中，滴加到NaF的溶液中，160-200° C氮气保护下，搅拌反应0.5_5h ；
c)叶酸功能化的上转换粒子的制备:称取0.10-1.0g的叶酸(FA)加入0.3g氢氧化钠(NaOH)溶解在IOmL 二甘醇+高纯水中，将步骤b)的反应体系降温到100°C，然后把制备的叶酸溶液边搅拌边滴加到反应体系中，在氮气保护下升温至160° C-2000 C，在此温度下搅拌氮气保护反应l_8h，自然冷却；
d)反应后处理:将步骤c)得到的反应后的溶液,转入到5mL的离心管中，在1000Orpm,10° C条件下离心5min,倾去上层清 液,加入2_3mL高纯水,超声15min,继续离心,按此步骤并洗涤四次，转移到表面皿，真空50°C干燥，得到叶酸功能化的上转换纳米粒子；
(2)氧化石墨烯的制备:
a)石墨的预氧化过程:向250mL三颈瓶中加入1.5g石墨薄片加入6mL浓硫酸、1.2gNa2S2(^P 1.25gP205，在80 ° C下搅拌4.5h，冷却至室温，加入250mL高纯水，放置过夜。离心至中性，35°C下真空干燥，得到固体的预氧化的石墨；
b)氧化石墨烯的制备:在0°C条件下，向装有0.5g预氧化的石墨薄片的三颈瓶中加入20mL浓硫酸，缓慢加入2.5gKMn04,升温至35° C，搅拌2个小时后，加入45mL高纯水再搅拌2个小时，加入120mL高纯水和3.5mLH202，用ILl: 10的HCl洗涤、离心，再用高纯水洗涤、离心至中性，放置在35 °C的真空烘箱中干燥，得到的氧化石墨称量后，加水形成溶液并超声，形成氧化石墨烯溶液以备用；
(3)叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料的制备:
将质量比为1/1-1/2的叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯分散在高纯水中，振荡lOmin，放入真空干燥箱中常温干燥，得到叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料。
[0009]( 4 )水溶性叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料在作为识别癌变细胞材料中的应用。
[0010]a) 0.01mol/L, pH=7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)的配制:称取氯化钠2.0OOlg,氯化钾0.0506g，磷酸二氢钾0.0603g，磷酸氢二钠0.8949g，加入高纯水溶解，用5mol/L盐酸调节PH为7.4，定容至250mL的容量瓶，放入冰箱中备用；b)我们选取两种细胞，人宫颈癌细胞(海拉细胞，Hela，癌细胞)和鼠胚胎成纤维细胞(3T3，正常细胞)，分别用含有10%的牛血清的DMEM细胞培养液培养，培养气氛为5%C02,温度为37°C，细胞种植密度为(24孔板)，培养24h后，除去培养液，每孔加入含有复合物的细胞培养液，培养4h后用磷酸缓冲溶液(PBS，0.01M, pH=7.4)冲洗3次，进行细胞成像。
[0011]本发明进一步公开了水溶性叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料在作为识别癌变细胞材料中的应用，水溶性叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料(FA-UCNPs/GO)可用于识别癌变细胞。癌变细胞与正常细胞相比，其表面的叶酸受体(FAR)比较多，而叶酸受体可以特异性地识别叶酸，进而可以识别FA-UCNPs，FA-UCNPs具有上转换荧光，当它与氧化石墨烯形成复合物时，氧化石墨烯使其荧光发生猝灭，当该复合材料(FA-UCNPs/GO)遇到叶酸受体时，叶酸受体识别并把FA-UCNPs转运到癌变细胞中，与GO脱离接触，荧光随即恢复，详见附图5。
[0012]本发明更加详细地描述了水溶性叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯的复合材料的制备方法:
一种水溶性叶酸功能化的上转换纳米粒子(FA-UCNPs)与氧化石墨烯(GO)的复合材料的制备方法，按如下的步骤进行:
一)水溶性叶酸功能化的上转换粒子的制备:
a)稀土硝化物的制备:将0.4mmol氧化乾Y203、0.09mmol氧化镱Yb203、0.01mmol氧化铒Er2O3,即乾、镱、铒物质的量之比Y/Yb/Er =80/18/2, Y+Yb+Er=lmmol,称好质量,放入50mL小烧杯中，加入1.5-3mL浓硝酸，4mL高纯水，在通风橱中100°C，硝化，蒸干；其中氧化钇Y2O3中Y的物质的量为0.8m`mol、氧化镱Yb2O3中Yb的物质的量为0.18mmol、氧化铒Er2O3中Er的物质的量为0.02mmol ；
b)二甘醇修饰的上转换粒子的制备:称取4-16mmol的NaF,放于IOOmL圆底烧瓶中，加入IOmL 二甘醇+高纯水，在氮气保护、磁子搅拌下，用油浴加热到160-200° C，向步骤a蒸干的小烧杯中加入12.5mL 二甘醇+高纯水，20° C加热，使硝化物溶解在二甘醇一高纯水溶剂中，滴加到NaF的溶液中，160-200° C氮气保护下，搅拌反应0.5_5h ；
c)叶酸功能化的上转换粒子的制备:称取0.10-1.0g叶酸(FA)加入0.3g氢氧化钠(NaOH)的二甘醇+高纯水中，将步骤b )的反应体系降温到100° C，然后把制备的溶液边搅拌边滴加到反应体系中，氮气保护下升温至160-200°C，在此温度下搅拌氮气保护反应l-8h，自然冷却；
d)反应后处理:将步骤c)得到的反应后的溶液,转入到5mL的离心管中，1000Orpm,10° C下离心5min,倾去上层清液,加入2_3mL高纯水,超声15min,继续离心,如此洗漆四次，转移到表面皿，真空50°C干燥，得到叶酸功能化的上转换纳米粒子。
[0013]二)氧化石墨烯(GO)的制备:
a)石墨的预氧化过程:向250mL三颈瓶中加入1.5g的石墨薄片加入6mL的浓硫酸、
1.2g的Na2S2O8和1.25g的P2O5=在80 °C下搅拌4.5h。冷却至室温，加入250mL水，放置过夜。离心至中性，35° C下真空干燥，得到固体的预氧化的石墨。
[0014]b)氧化石墨烯的制备:在0°C条件下，向装有0.5g的预氧化的石墨薄片的三颈瓶中加入20mL的浓硫酸，缓慢加入2.5g的ΚΜη04。升温至35°C，搅拌2个小时后，加入45mL高纯水再搅拌2个小时。加入120mL的高纯水和3.5mL的H202。用IL的1:10的HCl洗涤、离心，再用高纯水洗涤、离心至中性，放置在35 °C的真空烘箱中干燥。得到的氧化石墨称量后，加水形成溶液并超声，形成氧化石墨烯溶液以备用。
[0015]三)叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料(FA-UCNPs/GO)的制备:
将质量比为1/1-1/2的叶酸功能化的上转换纳米粒子(FA-UCNPs)与氧化石墨烯(GO)分散在高纯水中，振荡lOmin，放入真空干燥箱中常温干燥。
[0016]本发明公开的水溶性叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料(FA-UCNPs/GO)及其制备方法与现有的技术相比，具有以下的有益效果:
(I)本发明所提供的制备方法制备的叶酸功能化的上转换纳米粒子水溶性极好，在生物溶液中稳定(浓度lmg/mL时稳定存在)。
[0017](2)本发明所提供的制备方法制备的叶酸功能化的上转换纳米粒子可以被癌变细胞表面的叶酸受体(FAR)特异性的识别，从而起到识别癌变细胞的作用(见附图5)。
[0018](3)本发明所提供的制备方法制备的氧化石墨烯水溶性好，尺寸较小均匀且可以调控，在水溶液中非常稳定(浓度lmg/mL时稳定存在)。
[0019](4)本发明合成的叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料(FA-UCNPs/GO)，FA-UCNPs的荧光被猝灭，当遇到叶酸受体时，叶酸受体识别并转运FA-UCNPs到癌变细胞内，使其与GO脱离，荧光恢复。从而可以很明显识别癌变细胞(见附图6)。
[0020]【专利附图】
【附图说明】:
图1为叶酸功能化的的上转换纳米粒子(FA-UCNPS)，氧化石墨烯(GO)和复合物(FA-UCNPs/GO)的 XRD 图；
图2为叶酸功能化的的的上转换纳米粒子(FA-UCNPs，A图)，氧化石墨烯(G0，B图)和复合物(FA-UCNPs/G0，CD 图)的 TEM 图；
图3为叶酸功能化的的的上转换纳米粒子(FA-UCNPs)，氧化石墨烯(GO)和复合物(FA-UCNPs/GO)的的 FTIR 图;
图4为叶酸功能化的的上转换纳米粒子与叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合物(FA-UCNPs/GO，1/1，1/2)的荧光谱图；
图5为叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料(FA-UCNPs/GO)用于识别癌变细胞示意图；
图6为叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料(FA-UCNPs/GO)对于正常细胞荧光淬灭，对于癌症细胞荧光恢复，A、B分别是Hela细胞和3T3细胞与UCNPs/GO培养后的成像图，AB是暗场，A’B’是明场。
[0021]
【具体实施方式】
[0022]通过下面结合附图对其示例性实施例进行的描述，本发明上述特征和优点将会变得更加清晰和容易理解。下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明。
[0023]本发明所述的高纯水购买于天津师范大学水资源与水环境重点实验室(对外有售)，所述的氧化钇Y2O3 (99.99%)购买于上海化学试剂有限公司，氧化镱Yb2O3 (99.99%)购买于上海化学试剂有限公司，氧化铒Er2O3 (99.99%)购买于天津市光复精细化工研究所，叶酸(FA，97%)购买于天津市福晨化学试剂厂，二甘醇(分析纯，98.0%)购买于天津市光复精细化工研究所，石墨薄片(天然，-325目，99.8%)购买于Alfa Aesar，其他无机试剂均购买于天津市科威有限公司。
[0024]实施例1
一)水溶性叶酸功能化的上转换粒子的制备:
a)稀土硝化物的制备:将0.4mmol氧化乾Y203、0.09mmol氧化镱Yb203、0.0lmmol氧化铒Er2O3,即乾、镱、铒物质的量之比Y/Yb/Er =80/18/2, Y+Yb+Er=lmmol,称好质量,放入50mL小烧杯中，加入1.5mL浓硝酸，4mL高纯水，在通风橱中100°C，硝化，蒸干；其中氧化钇Y2O3中Y的物质的量为0.8mmol、氧化镱Yb2O3中Yb的物质的量为0.18mmol、氧化铒Er2O3中Er的物质的量为0.02mmol ；
b)二甘醇修饰的上转换粒子的制备:称取4mmolNaF，放于IOOmL圆底烧瓶中，加入2mL二甘醇+SmL高纯水，在氮气保护、磁子搅拌下，用油浴加热到160° C，向步骤a)蒸干的小烧杯中加入2.5mL 二甘醇+IOmL高纯水，20° C加热，使硝化物溶解在二甘醇一高纯水溶剂中，滴加到NaF的溶液中，160° C氮气保护下，搅拌反应3h ；
c)叶酸功能化的上转换粒子的制备:称取0.1Og叶酸(FA)加入0.3g氢氧化钠(NaOH)，溶解在IOmL的二甘醇+高纯水中，将步骤b)的反应体系降温到100°C，然后把制备的溶液边搅拌边滴加到反应体系中，氮气保护下升温至160°C，在此温度下搅拌氮气保护反应lh，自然冷却；
d)反应后处理:将步骤c)得到的反应后的溶液,转入到5mL的离心管中，IOOOOrpm,10°C下离心5min,倾去上层清液,加入3mL高纯水,超声15min,继续离心,如此洗漆四次，转移到表面皿上，真空50°C干燥，得到叶酸功能化的上转换纳米粒子。
[0025]二)氧化石墨烯(GO)的制备:
a)石墨的预氧化过程:向250mL三颈瓶中加入1.5g石墨薄片加入6mL浓硫酸、1.2gNa2S20jP 1.25gP205，在80 ° C下搅拌4.5h。冷却至是室温，加入250mL高纯水，放置过夜。离心至中性，35° C下真空干燥，得到固体的预氧化的石墨。
[0026]b)氧化石墨烯的制备:在0°C条件下，向装有0.5g预氧化的石墨薄片的三颈瓶中加入20mL浓硫酸，缓慢加入2.5gKMn04。升温至35° C，搅拌2个小时后，加入45mL高纯水再搅拌2个小时。加入120mL高纯水和3.5mLH202。用ILl: 10的HCl洗涤、离心，再用高纯水洗涤、离心至中性，放置在35 °C的真空烘箱中干燥。得到的氧化石墨称量后，加水形成溶液并超声，形成氧化石墨烯溶液以备用。
[0027]三)叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料(FA-UCNPs/GO)的制备:
将叶酸功能化的上转换纳米粒子(FA-UCNPs)与氧化石墨烯(GO)以质量比为1/1的比例分散在高纯水中，振荡lOmin，放入真空干燥箱中常温干燥。叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料(FA-UCNPs/GO)对于正常细胞荧光淬灭，对于癌症细胞荧光恢复。
[0028]实施例2
一)水溶性叶酸功能化的上转换粒子的制备: a)稀土硝化物的制备:将0.4mmol氧化乾Y203、0.09mmol氧化镱Yb203、0.0lmmol氧化铒Er2O3,即乾、镱、铒物质的量之比Y/Yb/Er =80/18/2, Y+Yb+Er=lmmol,称好质量,放入50mL小烧杯中，加入3mL浓硝酸，4mL高纯水，在通风橱中100°C，硝化，蒸干；其中氧化钇Y2O3中Y的物质的量为0.8mmol、氧化镱Yb2O3中Yb的物质的量为0.18mmol、氧化铒Er2O3中Er的物质的量为0.02mmol ；
b)二甘醇修饰的上转换粒子的制备:称取4mmol的NaF，放于IOOmL圆底烧瓶中，加入IOmL 二甘醇，在氮气保护、磁子搅拌下，用油浴加热到200° C，向步骤a蒸干的小烧杯中加入12.5mL 二甘醇，20° C加热，使硝化物溶解在二甘醇一高纯水溶剂中，滴加到NaF的溶液中，200° C氮气保护下，搅拌反应3h ；
c)叶酸功能化的上转换粒子的制备:称取0.1Og叶酸(FA)加入0.3g氢氧化钠(NaOH)溶解在IOmL 二甘醇中，将步骤b)的反应体系降温到100°C，然后把制备的溶液边搅拌边滴加到反应体系中，氮气保护下升温至200°C，在此温度下搅拌氮气保护反应2h，自然冷却；
d)反应后处理:将步骤c)得到的反应后的溶液,转入到5mL的离心管中，IOOOOrpm,10° C下离心5min,倾去上面液体,加入2mL高纯水,超声15min,继续离心,如此洗漆四次，转移到表面皿上，真空50°C干燥，得到叶酸功能化的上转换纳米粒子。
[0029]二)氧化石墨烯(GO)的制备:
a)石墨的预氧化过程:向250mL三颈瓶中加入1.5g石墨薄片加入6mL浓硫酸、UgNa2S2OJ 1.25gP205。在80 °C下搅拌4.5h。冷却至室温，加入250mL高纯水，放置过夜。离心至中性，35° C下真空干燥，得到固体的预氧化的石墨。
[0030]b)氧化石墨烯的制备:在0°C条件下，向装有0.5g预氧化的石墨薄片的三颈瓶中加入20mL浓硫酸，缓慢加入2.5gKMn04。升温至35° C，搅拌2个小时后，加入45mL高纯水再搅拌2个小时。加入120mL高纯水和3.5mLH202。用ILl: 10的HCl洗涤、离心，再用高纯水洗涤、离心至中性，放置在35 °C的真空烘箱中干燥。得到的氧化石墨称量后，加水形成溶液并超声，形成氧化石墨烯溶液以备用。
[0031]三)叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料(FA-UCNPs/GO)的制备:
将质量比为1/2的叶酸功能化的上转换纳米粒子(FA-UCNPs)与氧化石墨烯(GO)分散在高纯水中，振荡lOmin，放入真空干燥箱中常温干燥。叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料(FA-UCNPs/GO)对于正常细胞荧光淬灭，对于癌症细胞荧光恢复。
实施例3
一)水溶性叶酸功能化的上转换粒子的制备:
a)稀土硝化物的制备:将0.4mmol氧化乾Y203、0.09mmol氧化镱Yb203、0.0lmmol氧化铒Er2O3,即乾、镱、铒物质的量之比Y/Yb/Er =80/18/2, Y+Yb+Er=lmmol,称好质量,放入50mL小烧杯中，加入2mL浓硝酸，4mL高纯水，在通风橱中100° C，硝化，蒸干；其中氧化钇Y2O3中Y的物质的量为0.8mmol、氧化镱Yb2O3中Yb的物质的量为0.18mmol、氧化铒Er2O3中Er的物质的量为0.02mmol ；
b)二甘醇修饰的上转换粒子的制备:称取4mmolNaF，放于IOOmL圆底烧瓶中，加入2mL二甘醇+SmL高纯水，在氮气保护、磁子搅拌下，用油浴加热到160-200° C，向步骤a)蒸干的小烧杯中加入2.5mL 二甘醇+IOmL高纯水，20° C加热，使硝化物溶解在二甘醇一高纯水溶剂中，滴加到NaF的溶液中，160° C氮气保护下，搅拌反应3h ；
c)叶酸功能化的上转换粒子的制备:称取0.1Og叶酸(FA)加入0.3g氢氧化钠(NaOH)，溶解在IOmL的二甘醇+高纯水中，将步骤b)的反应体系降温到100°C，然后把制备的溶液边搅拌边滴加到反应体系中，氮气保护下升温至160°C，在此温度下搅拌氮气保护反应lh，自然冷却；
d)反应后处理:将步骤c)得到的反应后的溶液,转入到5mL的离心管中，IOOOOrpm,10° C下离心5min,倾去上面液体,加入2_3mL高纯水,超声15min,继续离心,如此洗漆四次，转移到表面皿上，真空50°C干燥，得到叶酸功能化的上转换纳米粒子。
[0032]二)氧化石墨烯(GO)的制备如实施例1
三)叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料(FA-UCNPs/GO)的制备:将质量比为1/1的叶酸功能化的上转换纳米粒子(FA-UCNPs)与氧化石墨烯(GO)分散在高纯水中，振荡lOmin，放入真空干燥箱中常温干燥。
[0033]实施例4
一)水溶性叶酸功能化的上转换粒子的制备:
a)稀土硝化物的制备:将0.4mmol氧化乾Y2O3>0.09mmol氧化镱Yb2O3、0.0lmmol氧化铒Er2O3,即镱与铒物质的量之比Yb/Er =9:1, Y+Yb+Er=lmmol,称好质量,放入50mL小烧杯中，加入3mL浓硝酸，4mL高纯水，在通风橱中100° C，硝化，蒸干；其中氧化钇Y2O3中Y的物质的量为0.8mmol、氧化镱Yb2O3中Yb的物质的量为0.18mmol、氧化铒Er2O3中Er的物质的量为 0.02mmo1 ；
b)二甘醇修饰的上转换粒子的制备:称取4mmolNaF,放于IOOmL圆底烧瓶中,加入8mL二甘醇+2mL高纯水，在氮气保护、磁子搅拌下，用油浴加热到160-200°C，向步骤a蒸干的小烧杯中加入IOmL 二甘醇+2.5mL高纯水，20° C加热，使硝化物溶解在二甘醇一高纯水溶剂中，滴加到NaF的溶液中，180° C氮气保护下，搅拌反应3h ；
c)叶酸功能化的上转换粒子的制备:称取0.20g的叶酸(FA)加入0.3g氢氧化钠(NaOH)，溶解在IOmL的二甘醇+高纯水中，将步骤b)的反应体系降温到100° C，然后把制备的溶液边搅拌边滴加到反应体系中，氮气保护下升温至180° C，在此温度下搅拌氮气保护反应Ih,自然冷却；
d)反应后处理:将步骤c)得到的反应后的溶液,转入到5mL的离心管中，IOOOOrpm,10° C下离心5min,倾去上面液体,加入3mL高纯水,超声15min,继续离心,如此洗漆四次，转移到表面皿上，真空50°C干燥，得到叶酸功能化的上转换纳米粒子。
[0034]二)氧化石墨烯(GO)的制备如实施例2
三)叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料(FA-UCNPs/GO)的制备:将质量比为1/2的叶酸功能化的上转换纳米粒子(FA-UCNPs)与氧化石墨烯(GO)分散在高纯水中，振荡lOmin，放入真空干燥箱中常温干燥。叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料(FA-UCNPs/GO)对于正常细胞荧光淬灭，对于癌症细胞荧光恢复。
[0035]实施例5
水溶性叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料(FA-UCNPs/GO)可用于识别癌变细胞。癌变细胞与正常细胞相比，其表面的叶酸受体(FAR)比较多，而叶酸受体可以特异性地识别叶酸，进而可以识别FA-UCNPs，FA-UCNPs是有上转换荧光的，当它与氧化石墨烯形成复合物时，氧化石墨烯使其荧光发生猝灭，当该复合材料(FA-UCNPs/GO)遇到叶酸受体时，叶酸受体将识别并把FA-UCNPs转运到癌变细胞中，这样与GO脱离接触，荧光随即恢复。我们选取两种细胞，人宫颈癌细胞(海拉细胞，Hela,癌细胞)和鼠胚胎成纤维细胞(3T3，正常细胞)，分别用含有10%的牛血清的DMEM细胞培养液培养，培养气氛为5%C02,温度为37°C，细胞种植密度为(24孔板)，培养24h后，除去培养液，每孔加入含有复合物的细胞培养液，培养4h后用磷酸缓冲溶液(PBS，0.01M, pH=7.4)冲洗3次，进行细胞成像(如图6)。
【权利要求】
1.叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料，其特征在于它是由质量比为1/1-1/2叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯组成。
2.权利要求1所述的水溶性叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行: (1)水溶性叶酸功能化的上转换粒子的制备: a)稀土硝化物的制备:将0.4mmol氧化乾Y203、0.09mmol氧化镱Yb203、0.01mmol氧化铒Er2O3,即乾、镱、铒物质的量之比Y/Yb/Er =80/18/2, Y+Yb+Er=lmmol,称好质量,放入50mL小烧杯中，加入1.5-3mL浓硝酸，4mL高纯水，在通风橱中100°C，硝化，蒸干；其中氧化钇Y2O3中Y的物质的量为0.8mmol、氧化镱Yb2O3中Yb的物质的量为0.18mmol、氧化铒Er2O3中Er的物质的量为0.02mmol ； b)二甘醇修饰的上转换粒子的制备:称取4-16mmol的NaF，放于IOOmL圆底烧瓶中，加入IOmL 二甘醇+高纯水，在氮气保护、磁子搅拌下，用油浴加热到160-200° C，向步骤a)蒸干的小烧杯中加入12.5mL 二甘醇+高纯水，20° C条件下加热，使硝化物溶解在二甘醇一高纯水溶剂中，滴加到NaF的溶液中，160-200° C氮气保护下，搅拌反应0.5_5h ； c)叶酸功能化的上转换粒子的制备:称取0.10-1.0g的叶酸(FA)和0.3g氢氧化钠(NaOH)加入IOmL 二甘醇+高纯水溶解，将步骤b)的反应体系降温到100°C，然后把制备的叶酸溶液边搅拌边滴加到反应体系中，氮气保护下升温至160-200° C，在此温度下搅拌氮气保护反应l_8h，自然冷却； d)反应后处理:将步骤c)得到的溶液，转入到5mL的离心管中，在10000rpm，10°C条件下离心5min,倾去上层清液,加入2_3mL高纯水,超声15min,继续离心,按此步骤并洗漆四次后转移到表面皿，在真空50°C条件下干燥，得到叶酸功能化的上转换纳米粒子； (2)氧化石墨烯的制备: a)石墨的预氧化过程:向250mL三颈瓶中加入1.5g石墨薄片后加入6mL浓硫酸、1.2gNa2S2(^P 1.25gP205，在80 ° C下搅拌4.5h，冷却至室温，加入250mL高纯水，放置过夜；离心至中性，35°C下真空干燥，得到固体的预氧化的石墨； b)氧化石墨烯的制备:在0°C条件下，向装有0.5g预氧化的石墨薄片的三颈瓶中加入20mL浓硫酸，缓慢加入2.5gKMn04,升温至35° C，搅拌2个小时后，加入45mL高纯水再搅拌2个小时，加入120mL高纯水和3.5mLH202，用IL的1:10HC1洗涤、离心，再用高纯水洗涤、离心至中性，放置在35 0C的真空烘箱中干燥，得到的氧化石墨称量后，加高纯水形成溶液并超声，形成氧化石墨烯溶液以备用； 叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料的制备: 将质量比为1/1-1/2的叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯分散在高纯水中，振荡lOmin，放入真空干燥箱中常温干燥，得到叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料。
3.权利要求1所述水溶性叶酸功能化的上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料在作为识别癌变细胞材料中的应用。
【文档编号】G01N21/64GK103698308SQ201310712830
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】李妍, 胡悦立, 靳晴, 孙玉秀, 陈晓芳 申请人:天津师范大学