一种基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术和医学检测研究领域的试剂盒，具体涉及一种基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒。

背景技术：

双夹心ELISA检测方法操作简单、高效、可靠、适用于大批样品快速筛选，基于单克隆抗体的双夹心ELISA较多克隆抗体更稳定，特异性更强。

颗粒蛋白前体(Progranulin，PGRN)是一种含有593个氨基酸的分泌性糖蛋白，含有7.5个半胱氨酸结构域，命名为GrnP，GrnG，GrnF，GrnB，GrnA，GrnC,GrnD，GrnE。PGRN与胚胎发育，损伤修复，炎症，肿瘤的发生发展等生理病理过程息息相关。研究表明，人血清中PGRN的含量与一些疾病有关，如：糖尿病，肿瘤，神经退行性疾病等，PGRN作为一种分泌性糖蛋白，可以作为诊断这些相关疾病的标志物，对于这些疾病的诊断、治疗、监控及预后提供了重要的依据，所以快速、准确、高灵敏度地检测相关病人血清中的PGRN蛋白的含量尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种简便、灵敏度高、特异性强、适应大规模检测的基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒。

为了实现上述任务，本发明通过以下技术方案得以实现：

一种基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒的内容物组成如下：96孔ELISA酶标板、包被抗体4F10、人PGRN标准蛋白、生物素标记的检测抗体5B7-biotin、Avidin与HRP的交联蛋白、包被缓冲液、封闭液、样品及检测抗体稀释液、ELISA酶标板洗涤液、底物液和终止液。

根据本发明，所述包被抗体4F10是针对人PGRN中GrnA结构域的小鼠抗人单克隆抗体，工作浓度为10μg/mL。

进一步地，所述生物素标记的检测抗体5B77-biotin是针对人PGRN中GrnB结构域的小鼠抗人单克隆抗体，工作稀释比例为1：4000。

所述的包被缓冲液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6；

所述封闭液为含体积分数为10％小牛血清的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；

所述样品及检测抗体稀释液为含体积分数为1％小牛血清的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；

所述ELISA酶标板洗涤液为含体积分数为0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；

所述底物液为TMB，即四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine)底物缓冲液；

所述终止液为摩尔浓度为2M的浓硫酸溶液。

所述人PGRN标准蛋白通过真核蛋白纯化的方法获得；所述Avidin与HRP的交联蛋白是采用过碘酸钠法将纯化的Avidin与HRP蛋白交联。

所述的过碘酸钠法是将HRP与过碘酸钠(NaIO4)反应，获得活化的HRP；

所述的Avidin与活化的HRP反应，获得Avidin与HRP的交联蛋白。

根据申请人的试验表明，本发明的基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，可以用于乳腺癌、肺癌及Ⅱ型糖尿病病人的血清学的检测应用。

所述乳腺癌、肺癌及Ⅱ型糖尿病病人的血清学的检测是检测重组的PGRN蛋白以及天然的人PGRN蛋白。

检测重组的PGRN蛋白以及天然的人PGRN蛋白具体包括以下步骤：

(1)包被ELISA酶标板：用包被缓冲液将包被抗体4F10稀释成10μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；

(2)封闭：甩去孔中液体，加入200μL/孔的ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次后，加入200μL/孔的封闭液，37℃、2h后，洗涤3-5次，并甩干；

(3)加待检测样品：向所述酶标板中加入待检测样品，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；

(4)加检测抗体：向所述酶标板中加入5B7-biotin，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；

(5)加Avidin与HRP的交联蛋白：向所述酶标板中加入Avidin与HRP的交联蛋白，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤5-6次，并甩干；

(6)显色：向所述酶标板中加入底物液，100μL/孔，37℃、3-5min。

(7)终止：向所述酶标板中加入终止液，50μL/孔，反应后,酶标仪450nm处读数。

本发明的基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒与现有技术相比，带来的有益技术效果在于：

(1)所采用包被抗体和酶标抗体均为针对PGRN的单克隆抗体，较多克隆抗体更稳定，特异性更强；

(2)可快速检测癌症及糖尿病病人血清中的PGRN蛋白含量，由多功能酶标仪进行定量分析，结果准确可靠，为临床检验和基础研究提供了一种新的辅助工具。

附图说明

图1是适用于检测人PGRN双夹心ELISA试剂盒的抗体最优配对筛选；

图2是基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒的优化；

图3是基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒检测灵敏度的确定；

图4是双夹心ELISA试剂盒检测不同人群血清中PGRN蛋白的结果，其中A图中，NGT为非糖尿病人群，T2D为Ⅱ型糖尿病病人，B图中，Breast cancer group为乳腺癌人群，lung cancer为肺癌人群，Health group为健康人对照。

以下结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

具体实施方式

本实施例给出一种基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒。

第一方面，采用单克隆抗体是运用杂交瘤细胞技术，通过人PGRN各个结构域Grns蛋白分别免疫小鼠，将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经过细胞克隆化与间接ELISA方法获得的11株针对人PGRN各个结构域的小鼠抗人单克隆抗体：4G3，2E2，1G6，4E8，5B7，4F10，2A5，3C5，3F9，1D5，3F7；再对11株单克隆抗体进行生物素(Biotin)标记，将包被抗体与酶标抗体分别进行双夹心抗体配对，筛选出最佳单克隆抗体配对：4F10(针对GrnA domain)和5B7(针对GrnB domain)

第二方面，本实施例给出的基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，该试剂盒的内容物组成如下：96孔ELISA酶标板、包被抗体4F10、人PGRN标准蛋白、生物素标记的检测抗体5B7-biotin、Avidin与HRP的交联蛋白、包被缓冲液、封闭液、样品及检测抗体稀释液、ELISA酶标板洗涤液、底物液和终止液。

其中：

(1)包被抗体4F10的最优的抗体工作浓度为10μg/mL；

(2)人PGRN标准蛋白，通过真核蛋白纯化的方法获得；

(3)生物素标记的检测抗体5B7-biotin，通过生物素标记试剂盒(Thermo公司售)获得，工作最佳稀释比例：1：4000。

(4)Avidin与HRP的交联蛋白，通过过碘酸钠法是HRP与过碘酸钠(NaIO4)反应，获得活化的HRP；Avidin与活化的HRP反应，获得Avidin与HRP的交联蛋白。

(5)包被缓冲液，0.05M的碳酸盐缓冲液(pH 9.6)；

(6)封闭液，含体积分数为10％小牛血清的磷酸盐缓冲液(pH7.4)；

(7)样品及检测抗体稀释液，含体积分数为1％小牛血清的磷酸盐缓冲液(pH7.4)；

(8)ELISA酶标板洗涤液，含体积分数为0.1％Tween-20的PBS(PBST，pH7.4)；

(9)底物液，含TMB的底物缓冲液；

第三方面，本实施例给出的基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒，可以用于乳腺癌、肺癌及Ⅱ型糖尿病病人的血清学的检测应用。即检测重组的PGRN蛋白以及天然的人PGRN蛋白。

检测重组的PGRN蛋白以及天然的人PGRN蛋白具体包括以下步骤：

(1)包被ELISA酶标板：用包被缓冲液将包被抗体4F10稀释，100μL/孔，4℃过夜；

(2)封闭：甩去孔中液体，加入200μL/孔的ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次后，加入200μL/孔的封闭液，37℃、2h后，洗涤3-5次，并甩干；

(3)加待检测样品：向所述酶标板中加入待检测样品，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；

(4)加检测抗体：向所述酶标板中加入5B7-biotin，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；

(5)加Avidin与HRP的交联蛋白：向所述酶标板中加入Avidin与HRP的交联蛋白，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤5-6次，并甩干；

(6)显色：向所述酶标板中加入底物液，100μL/孔，37℃、3-5min。

(7)终止：向所述酶标板中加入终止液，50μL/孔，反应后,酶标仪450nm处读数。

以下是发明人给出的具体实施例，本发明并不限于以下的实施例。

实施例1：双夹心ELISA抗体配对的筛选

(1)包被抗体：将纯化后的针对人PGRN各结构域的单克隆抗体anti-GrnG(4G3，2E2),anti-GrnF((1G6,4E8),anti-GrnB(5B7),anti-GrnA(4F10),anti-GrnC(2A5),anti-GrnD(3C5,3F9),anti-GrnE(1D5,3F7),稀释至10μg/mL，按照100μL/孔包被，4℃过夜；

(2)封闭：甩去孔中液体，加入200μL/孔的ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次后，加入200μL/孔封闭液，37℃、2h后，洗涤3-5次，并甩干；

(3)加PGRN蛋白样品：向所述酶标板中加入PGRN蛋白样品(0.5μg/mL)，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；

(4)加检测抗体：向所述酶标板中加入生物素标记的单克隆抗体，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；

(5)加Avidin与HRP的交联蛋白：向所述酶标板中加入Avidin与HRP的交联蛋白，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤5-6次，并甩干；

(6)显色：向所述酶标板中加入底物液，100μL/孔，37℃、3-5min；

(7)终止：向所述酶标板中加入终止液，50μL/孔，反应后,酶标仪450nm处读数。

配对结果如图1所示，其中适用于检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒的最优配对抗体为：包被抗体4F10和生物素标记的检测抗体5B7-biotin。

实施例2：Avidin与HRP蛋白交联

通过过碘酸钠法将Avidin与HRP进行交联，具体为：

首先HRP与过碘酸钠(NaIO4)反应，获得活化的HRP；Avidin与活化的HRP反应，获得Avidin与HRP的交联蛋白。

实施例3：双夹心ELISA试剂盒优化

(1)包被抗体的优化

包被抗体选用针对GrnA的单克隆抗体4F10，将单克隆抗体4F10按照40μg/mL，20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL浓度梯度进行包被，封闭后，加入PGRN蛋白0.1μg/mL反应1h，将检测抗体5B7-Biotin加入检测孔中，37℃、1h后，洗涤3-5次，在反应孔中加入Avidin-HRP，37℃、1h后，洗涤5-6次，加入底物液进行显色，反应3-5min后将反应孔中加入终止液，于450nm处测量OD值。测量OD值减空白OD值最大的为较优的包被抗体浓度，结果如图2的A图所示，10μg/mL为最佳包被浓度。

(2)检测抗体的优化

检测抗体选用针对GrnB单克隆抗体5B7，使用生物素(Biotin)对5B7抗体进行标记，获得5B7-Biotin。对检测抗体Biotin-5B7的浓度进行优化，将Biotin-5B7按照1/250、1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16000、1/32000进行梯度稀释，按照上述方法进行检测。选择测量OD值最大同时检测抗体最低浓度为最佳稀释浓度，结果如图2的B图所示，1/4000为最佳稀释浓度。

(3)检测灵敏度的确定

使用优化的包被抗体浓度包被、封闭后，加入梯度稀释的PGRN真核表达蛋白，37℃、1h后，洗涤3-5次，在待测孔中5B7-Biotin检测抗体(1:4000)，37℃、1h后，洗涤3-5次，分别加入Avidin-HRP交联蛋白，37℃、1h后，洗涤5-6次，再加入底物液进行反应，于450nm处测量，结果如图3所示，可检测灵敏度为125pg/mL-63pg/mL，可检测到的范围为8ng/mL-125pg/mL。

实施例5：基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒的检测方法

(1)包被ELISA酶标板：包被缓冲液将包被抗体4F10稀释成10μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；

(2)封闭：甩去孔中液体，加入200μL/孔的ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次后，加入200μL/孔的封闭液，37℃、2h后，洗涤3-5次，并甩干；

(3)加待检测样品：将待测样品进行适当稀释，加入所述的酶标板中，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤3-5次，并甩干；

(4)加检测抗体：向所述酶标板中加入5B7-biotin，100μL/孔，37℃、1-2h后，洗涤3-5次，并甩干；

(5)加Avidin与HRP的交联蛋白：向所述酶标板中加入Avidin与HRP的交联蛋白，100μL/孔，37℃、1h后，洗涤5-6次，并甩干；

(6))显色：向所述酶标板中加入底物液，100μL/孔，37℃、3-5min；

(7)终止：向所述酶标板中加入终止液，50μL/孔，反应后，酶标仪450nm处读数。

实施例6：基于单克隆抗体检测人PGRN的双夹心ELISA试剂盒的应用

用实施例5建立的ELISA方法检测30例癌症病人(样本来源于山西省汾阳医院，其中23例肺癌，7例乳腺癌)和30例正常健康人群(健康人群选自陕西师范大学学生体检样本)；205例Ⅱ型糖尿病病人(样本来源于南京第一人民医院)和78例正常健康人群(健康人群选自陕西师范大学学生体检样本)，将PGRN重组蛋白作为阳性对照，根据所得标准品OD值与所对应浓度绘制标准曲线，计算各人群中PGRN蛋白的血清学水平。

结果如图4所示，乳腺癌、肺癌及糖尿病症组人群PGRN蛋白的血清学水平明显高于正常人，差异有统计学意义(p<0.001)。