一种精氨酸溶液的检测方法与流程

本发明关于精氨酸杂质检测
技术领域：
，尤其涉及一种精氨酸溶液的检测方法。
背景技术：
：精氨酸是一种人体自身能合成营养素，是一种非必需胺基酸。精氨酸在人体内能转换成一氧化氮，并间接使血管舒张、调节免疫功能、减少细胞发炎、预防感染，在临床上研究发现对于预防心血管疾病、糖尿病、高血压及提升性功能都有帮助。目前，精氨酸已经能够进行成熟的工业化生产，在精氨酸的实际生产中需要对中间产品、成品进行取样检验其杂质情况，目前都采用薄层色谱法进行检测，灵敏度低、检测时间长(一般至少需要3～4小时)，同时有其它杂质也不能定性和定量分析。因此，现有技术中精氨酸溶液的检测方法还存在诸多缺陷。技术实现要素：针对采用薄层色谱法检测精氨酸灵敏度低、检测时间长的问题，本发明提供一种精氨酸溶液的检测方法。为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：一种精氨酸溶液的检测方法，包括如下步骤：步骤a、分别配制含有精氨酸和杂质对照品的至少5组标准溶液，且所述至少5组标准溶液中，所述精氨酸的浓度各不相同，所述杂质对照品的浓度各不相同；步骤b、用高效液相色谱法对所述标准溶液进行梯度检测，根据所得峰面积分别绘制精氨酸和杂质对照品的标准曲线，按照标准曲线得出精氨酸和杂质对照品的浓度-峰面积线性回归方程；步骤c、提供待测样品，在与步骤b相同的条件下，对所述待测样品进行检测，将得到的峰面积代入浓度-峰面积线性回归方程，计算对照品杂质的含量。相对于现有技术而言，本发明采用高效液相色谱法对精氨酸溶液进行检测，不仅可以更精确地检测出待测品中有无杂质，还能检测出杂质的具体含量，检测灵敏度高、检测限低，便于生产的分析、控制。杂质对照品可以为1种或多种，当杂质对照品为多种时，5组标准溶液中，各种杂质对照品的浓度均不相同。并且，当样品数量过多时，本发明所采用的高效液相色谱法在同样的时间内可以检测多个样品，极大地提高了工作效率。检测灵敏度高、检测限低，可以对精氨酸内的杂质进行准确的定量检测，并且检测时间短，显著提高了检测的工作效率。附图说明下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：图1是本发明实施例1的标准溶液高效液相色谱图；图2是本发明实施例1的待测品溶液高效液相色谱图；图3是本发明实施例中1的标准曲线。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例提供一种精氨酸溶液的检测方法，包括如下步骤：步骤a、分别配制含有精氨酸和杂质对照品的至少5组标准溶液，且所述至少5组标准溶液中，所述精氨酸的浓度各不相同，所述杂质对照品的浓度各不相同；步骤b、用高效液相色谱法对所述标准溶液进行梯度检测，根据所得峰面积分别绘制精氨酸和杂质对照品的标准曲线，按照标准曲线得出精氨酸和杂质对照品的浓度-峰面积线性回归方程；步骤c、提供待测样品，在与步骤b相同的条件下，对所述待测样品进行检测，将得到的峰面积代入浓度-峰面积线性回归方程，计算对照品杂质的含量。本发明采用高效液相色谱法对精氨酸中的有关物质进行检测，与薄层色谱法相比，使用薄层色谱法只能检测出待测品中有无杂质、杂质含量小于多少，而无法得知具体含量，且当对照溶液的浓度稍低时则显示不清楚或观测不到，检测限较高，但高相液相色谱法的检测不仅可以更精确地检测出待测品中有无杂质，还能检测出杂质的具体含量，检测灵敏度高、检测限低，可以对精氨酸内的杂质进行准确的定量检测，便于生产的分析、控制。杂质对照品可以为1种或多种，当杂质对照品为多种时，5组标准溶液中，各种杂质对照品的浓度均不相同。本方法所采用的绘制标准曲线的方法比自身对照法具有更低的检出限，更准确地检测出精氨酸中的有关物质。并且，薄层色谱法检测一个样品至少需要3～4小时的时间，当样品数量过多时可能影响生产进度，但本发明所采用的高效液相色谱法在同样的时间内可以检测多个样品，极大地提高了工作效率。具体地，步骤a中所述杂质对照品为2-亚氨基-1,3-二氮杂环庚烷-4-羧酸和3氨基-哌啶酮。这两个杂质是影响精氨酸产品稳定性的主要杂质，定量控制后才能有效控制产品质量。进一步优选地，所述精氨酸和杂质对照品的浓度范围为4～60mg/l。该浓度在检测限范围内，在浓度范围内的精氨酸溶液可以得到线性良好的标准曲线。杂质对照品可以为1种或多种，当杂质对照品为多种时，5组标准溶液中，各种杂质对照品的浓度均不相同。进一步优选地，所述标准溶液的溶剂为纯化水。精氨酸及杂质对照品均溶于水，水与流动相可以与流动相以任意比例混溶，且在进样量范围内的纯化水不会对流动相的性质产生影响，故以纯化水作为标准溶液的溶剂。步骤b中所述检测波长为204～206nm，该检测波长可兼顾精氨酸和杂质对照品的紫外吸收波长，尤其更为接近杂质对照品的紫外吸收波长，从而可以更为准确地检测出待测溶液中的对照品杂质的含量。步骤b、步骤c中，采用高效液相色谱法进行梯度检测的色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；柱温为25～35℃；流动相：流动相a为4～6mmol/l辛烷磺酸钠缓冲溶液，用磷酸调节ph值至1.9～2.1，流动相b为乙腈，进行线性梯度洗脱，所述线性洗脱梯度如下：流动相a选用辛烷磺酸钠缓冲液，辛烷磺酸钠属于离子对试剂，而精氨酸水溶液为强碱性，故使用辛烷磺酸钠缓冲液以使精氨酸能够在色谱柱上能够得以保留。柱温范围接近室温，容易控制温度使其稳定，样品在该温度范围内分离良好。优选的色谱条件可以更精确地检测出待测品中的杂质，检测灵敏度高、检测限低，提高检测结果的准确性以及适用范围，并提高了检测效率。进一步优选地，所述流动相a为5mmol/l辛烷磺酸钠缓冲液，该浓度的辛烷磺酸钠缓冲液以使精氨酸能够在色谱柱上能够更好地保留。进一步优选地，所述柱温为30℃。该温度更适用于十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，且温度接近室温，容易控制温度使其稳定，样品在该温度下分离效果更好。为了更好的说明本发明实施方式，下面通过实施例做进一步的举例说明。实施例1本发明实施例提供了一种精氨酸溶液的检测方法，包括如下步骤：步骤a、精密量取精氨酸、2-亚氨基-1,3-二氮杂环庚烷-4-羧酸、3氨基-哌啶酮各40mg，至100ml容量瓶中，加纯化水溶解后定容至刻度，取1ml至100ml容量瓶中，加纯化水定容至刻度，既得4mg/l标准溶液；同法配制12、20、40、60mg/l标准溶液。步骤b、用高效液相色谱法对所述标准溶液进行检测，色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：流动相a为5mmol/l辛烷磺酸钠缓冲溶液，用磷酸调节ph值至2.0，流动相b为乙腈；柱温为30℃；检测波长为205nm；进行线性梯度洗脱，所述线性洗脱梯度如下：时间/min流动相a/％流动相b/％将步骤b检测所得精氨酸、杂质对照品的含量绘制标准曲线，得出线性回归方程。实施例2本发明实施例提供了一种精氨酸溶液的检测方法，包括如下步骤：步骤a、精密量取精氨酸、2-亚氨基-1,3-二氮杂环庚烷-4-羧酸、3氨基-哌啶酮各40mg，至100ml容量瓶中，加纯化水溶解后定容至刻度，取1ml至100ml容量瓶中，加纯化水定容至刻度，既得4mg/l标准溶液；同法配制12、20、40、60mg/l标准溶液。步骤b、用高效液相色谱法对所述标准溶液进行检测，色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：流动相a为4mmol/l辛烷磺酸钠缓冲溶液，用磷酸调节ph值至1.9，流动相b为乙腈；柱温为25℃；检测波长为206nm；进行线性梯度洗脱，所述线性洗脱梯度如下：时间/min流动相a/％流动相b/％将步骤b检测所得精氨酸、杂质对照品的含量绘制标准曲线，得出线性回归方程。实施例3本发明实施例提供了一种精氨酸溶液的检测方法，包括如下步骤：步骤a、精密量取精氨酸、杂质1(2-亚氨基-1,3-二氮杂环庚烷-4-羧酸)、杂质2(3氨基-哌啶酮)各40mg，至100ml容量瓶中，加纯化水溶解后定容至刻度，取1ml至100ml容量瓶中，加纯化水定容至刻度，既得4mg/l标准溶液；同法配制12、20、40、60mg/l标准溶液。步骤b、用高效液相色谱法对所述标准溶液进行检测，色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：流动相a为6mmol/l辛烷磺酸钠缓冲溶液，用磷酸调节ph值至2.1，流动相b为乙腈；柱温为35℃；检测波长为204nm；进行线性梯度洗脱，所述线性洗脱梯度如下：时间/min流动相a/％流动相b/％将步骤b检测所得精氨酸、杂质对照品的含量绘制标准曲线，得出线性回归方程。将实施例1所得峰面积和浓度的关系求得相关系数r和线性方程，结果见下表1，标准溶液的高效液相色谱图见图1，标准曲线见图3：表1实施例1峰面积浓度和相应浓度对表1中的检测结果进行线性分析，得到线性方程及校正因子见表2：表2实施例1检测结果的线性方程及相关系数名称线性方程相关系数精氨酸y＝5.1951x+6.1656r＝0.9999杂质1y＝26.087x+0.8774r＝0.9999杂质2y＝26.407x+3.2603r＝0.9999检测待测样品：将待测样品溶解于纯化水中，配制成4mg/ml的待测溶液，另取杂质2-亚氨基-1,3-二氮杂环庚烷-4-羧酸以及3氨基-哌啶酮的对照品适量以及供试品溶液适量，置于同一量瓶中，用溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含精氨酸、杂质2-亚氨基-1,3-二氮杂环庚烷-4-羧酸、杂质3氨基-哌啶酮均为4μg的溶液，作为对照品溶液，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6×250mm，5μm)；以缓冲液(5mmol/l辛烷磺酸钠溶液，用磷酸调ph值至2.0)为流动相a，以乙腈为流动相b；柱温为30℃；检测波长为205nm。按照高效液相色谱仪的检测标准程序进行操作，测得2-亚氨基-1,3-二氮杂环庚烷-4-羧酸峰面积为11.3，待测品溶液的高效液相色谱图见图2。根据上述理论线性方程计算出待测样品中精氨酸中含2-亚氨基-1,3-二氮杂环庚烷-4-羧酸的浓度为0.400mg/ml，因此待测样品中2-亚氨基-1,3-二氮杂环庚烷-4-羧酸的含量为10％。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12