，该允许在一个相对较小的样品中 确定中期因子水平，所述样品如细针穿刺。在本发明的一些方面中，用于检测中期因子水平 的所述免疫测定，包括将所述样品与溶液接触的步骤，所述溶液包括（i)抗体，所述抗体与 人中期因子特异性结合W及（ii)聚合物。不希望受理论的束缚，据信在抗原结合过程中， 聚合物的存在增加了抗中期因子抗体对中期因子的亲和性或亲合力，和/或降低抗中期因 子抗体与存在于样品中的其它组分的非特异性结合，从而增加了免疫测定的灵敏度。
[0049] 存在于溶液中的抗中期因子抗体的量没有特别的限制，可W由本领域的技术人员 凭经验确定。在一些实施方式中，抗体浓度为0. 01yg/mL或更高，例如，0. 1yg/mL或更高、 1yg/mL或更高、5yg/mL或更高、10yg/mL或更高或25yg/mL或更高。或者，或另外地， 抗体浓度为100yg/mL或更低，例如50yg/mL或更低、25yg/mL或更低、10yg/mL或更低、 5yg/mL或更低、2yg/mL或更低、1yg/mL或更低或0. 5yg/mL或更低。因此，抗原结合过 程中存在于溶液中的抗中期因子抗体的浓度可由任意两个上述端点来限定的浓度。例如， 抗体浓度可W是 0. 1yg/mL-5yg/mL、1yg/mL-25yg/mL、0. 01yg/mL-1yg/mL或 5yg/ mL-10yg/mL。
[0050] 在某些实施方式中，所述免疫测定法包括使用两种或更多种不同的抗中期因子抗 体。用于本发明的方法或试剂盒中的每种抗中期因子抗体的浓度可W独立地由本领域的技 术人员进行选择。
[0化1] 在某些实施方式中，所述聚合物是聚-心赖氨酸或其盐或衍生物。存在于溶液中 的聚-k赖氨酸的量没有特别的限制。在一些实施方式中，在抗原结合过程中存在于溶液 中的聚斗-赖氨酸的浓度为0. 1yg/mL或更高，例如，0. 5yg/mL或更高、1yg/mL或更高、 5yg/mL或更高、10yg/mL或更高或者25yg/mL或更高。或者，或另外地，在抗原结合过 程中存在于溶液中的聚心赖氨酸的浓度为1000yg/mL或更低，例如，500yg/mL或更低、 250yg/mL或更低、100yg/mL或更低、50yg/mL或更低、20yg/mL或更低、10yg/mL或更 低、或者1yg/mL或更低。因此，在抗原结合过程中存在于溶液中的聚心赖氨酸的浓度可W 是由任意两个上述端点来限定的浓度。例如，在抗原结合过程中存在于溶液中的聚-k赖 氨酸的浓度可W是 0. 1yg/mL-500yg/mL、0. 5yg/mL-50yg/mL、1yg/mL-100yg/mL或 5yg/mL-20yg/mL。在一些实施方式中，在抗原结合过程中存在于溶液中的聚-k赖氨酸 的浓度为10yg/mL。
[0052] 所述聚A-赖氨酸的分子量没有特别限制。在某些实施方式中，所述聚-心赖 氨酸具有的分子量为 0. 5kDa-2kDa、lkDa-5kDa、4kDa-15kDa、15kDa-30kDa、30kDa-70kDa、 70kDa-150kDa或150kDa-300kDa。所述聚A-赖氨酸可W是游离碱的形式，或聚A-赖氨 酸可W是盐的形式，例如聚-k赖氨酸盐酸盐或聚-k赖氨酸氨漠酸盐。
[0053] 在一些实施方式中，含有特异性结合人中期因子的抗体的溶液包含聚合物，所述 聚合物是聚-k赖氨酸的衍生物。合适的聚-k赖氨酸的衍生物包括，例如，聚-k赖氨酸 和聚-D-赖氨酸的共聚物，偶联到蛋白的聚-k赖氨酸，W及聚-k赖氨酸和聚（己二醇） 的共聚物。
[0054] 在其他实施方式中，含有特异性结合人中期因子的抗体的溶液包含聚合物，所述 聚合物具有类似于聚赖氨酸的生理化学性质。因此，在本发明的某些实施方式中，含有 特异性结合人中期因子的抗体的溶液包含另一种带正电荷的水溶性聚合物，如聚-D-赖氨 酸或聚精氨酸。
[0055] 虽然样本的精确大小没有限制，但在本发明的方法和试剂盒中使用的样品可包 含少至0.Img总蛋白，例如0. 5mg总蛋白或更多、0. 6mg总蛋白或更多、0. 8mg总蛋白或更 多、1.Omg总蛋白或更多、1. 5mg总蛋白或更多、3.Omg总蛋白或更多、lOmg蛋白或更多或者 25mg蛋白或更多。或者，或另外地，所述样品可含有200mg蛋白或更少，例如lOOmg总蛋白 或更少、50mg总蛋白或更少、30mg总蛋白或更少、20mg总蛋白或更少、7. 5mg总蛋白或更少、 Img总蛋白或更少或者0.75mg总蛋白或更少。因此，本发明的方法和试剂盒中使用的样 品中总蛋白的量可W是由任意两个上述端点来限定的量。例如，本发明的方法和试剂盒中 使用的样品中总蛋白的量可W是 0.lmg-20mg、0. 5mg-7. 5mg、l. 0mg-100mg、3. 0mg-30mg或 10mg-200mg〇
[0化6] 根据本发明的试剂盒包括至少两个组分，即抗中期因子抗体和指导材料。在某些 实施方式中，所述试剂盒包括两种或更多种不同的抗中期因子抗体。所述指导材料包括（a) 用于确定样品中中期因子的水平和（b)用于解释确定的结果的指令。优选地，指导材料还 包括用于确定对照中的中期因子水平的指令，和/或提供一个或多个用于中期因子的对照 水平（例如，临界值）。
[0化7] 在一些实施方式中，所述指导材料描述将所述样品与溶液接触的步骤，所述溶液 包含抗中期因子抗体和聚合物。在某些实施方式中，聚合物是聚赖氨酸，或其盐或衍生 物，如在上述本发明方法的上下文中所描述的。
[005引在某些实施方式中，所述指导材料包括指令，所述指令用于确定从甲状腺生长获 得的样品中的中期因子水平并诊断甲状腺生长是良性或恶性。
[0059] 本发明的试剂盒可用于诊断从任何对象（特别是哺乳动物）获得的生长。优选的 哺乳动物是人。在其他实施方式中，所述哺乳动物可W是小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、羊、牛、 灵长类动物或另一哺乳动物。
[0060] 所述样品和对照可W是如上所述适用于本发明的方法的任何样品或对照。
[006U多效生长因子由PTN基因在人体内编码，在氨基酸序列同源性和结构相似性上与 中期因子密切相关。多效生长因子也被称为肝素结合性大脑有丝分裂原（皿BM)，肝素结合 性生长因子8 (皿GF-8)，神经突生长促进因子1 (肥GF1)，肝素亲和性调节肤（HAR巧和肝素 结合性生长相关分子化B-GAM)。同时，中期因子和多效生长因子组成的肝素结合性蛋白 家族通常被称为神经突生长促进因子（肥GF)家族（Muramatsu等，Proc.化n.Acad. ,Ser. B,86:410-425(2010))。
[0062]PTN基因表达在数种癌症中增加，所述癌症包括膜腺癌、绒毛膜癌、神经母细胞瘤 和黑素瘤（Muramatsu,J.Biochem., 132:359-371 (2002))。此外，多效生长因子的血清水平 在具有膜腺癌和结肠癌的患者体内增加（Muramatsu，出处同上）。
[0063] 因此，本发明还提供了方法和试剂盒，所述方法和试剂盒用于根据生长样品中存 在的多效生长因子水平来确定生长是良性还是恶性。在一个方面，本发明提供了诊断对象 中生长的方法。所述方法包括（a)提供获取自对象的生长样品，化）通过免疫测定来分析 所述样品W确定多效生长因子的水平，W及（C)将从所述样品确定的多效生长因子水平与 对照比较。与所述对照比较，从所述样品确定的多效生长因子水平是良性生长或恶性生长 的诊断依据。
[0064] 在另一个方面，本发明提供了诊断对象中生长的试剂盒。所述试剂盒包括（a)抗 体，所述抗体与人多效生长因子特异性结合，W及化）指导材料，所述指导材料用于通过免 疫测定来确定与对照比较的、获取自对象的生长样品中的多效生长因子水平。与所述对照 比较，从所述样品确定的多效生长因子水平是良性生长或恶性生长的诊断依据。
[0065] 用于根据存在于生长样品中的多效生长因子水平来确定生长是良性还是恶性的 所述方法和试剂盒的实施方式，和上文所述的与中期因子相关的方法和试剂盒的实施方式 相似，不同的是中期因子特异性抗体被多效生长因子特异性抗体所取代。
[0066] 多效生长因子特异性抗体可W通过本领域中已知的任何合适的方式来产生，例 如那些在本申请中所描述的与抗中期因子抗体的产生有关的方式。多效生长因子特异性 抗体也可W是在本领域中已知的抗多效生长因子抗体，例如市售可得的来自EMD密理博 (Millipore)公司（马萨诸塞州比勒利卡）或R&D系统公司（明巧苏达州明巧阿波利斯） 的抗多效生长因子抗体。在某些实施方式中，所述抗多效生长因子抗体是市售可得的、被称 为3B10的小鼠单克隆抗多效生长因子抗体。
[0067] 在一些实施方式中，用于根据存在于生长样品中的多效生长因子水平来确定生长 是良性还是恶性的所述方法和试剂盒，包括如上述与根据中期因子的方法和试剂盒相关的 聚合物的使用，所述聚合物如聚-k赖氨酸。在其他实施方式中，用于根据存在于生长样品 中的多效生长因子水平来确定生长是良性还是恶性的所述方法和试剂盒不包括聚合物的 使用。
[0068] 下列实施例进一步说明本发明，但是，当然，不应该被解释为W任何方式限制其范 围。
[00例实施例1
[0070] 本实施例说明了用于诊断甲状腺结节的方法，所述诊断是通过免疫测定确定甲状 腺结节样品中的中期因子水平来进行。
[0071] 从患有甲状腺结节的成年对象中获得甲状腺组织的样品，所述对象经受经皮细针 穿刺（FNA)(n= 41)、甲状腺切除术（n= 23)，或经皮FNA和甲状腺切除术（n= 9)。为获 得样品，将25号针反复进入结节（或者在体内经皮FNA，或者在甲状腺切除术后立即离体来 模仿经皮FNA)，在将一部分样品呈现到显微镜载玻片上用于常规细胞学分析之前或之后， 用500uL含有1 %牛血清白蛋白炬SA)的磯酸盐缓冲盐水（PB巧来漂洗针。漂洗物（也被 称为"洗脱物"）被等分并贬存在-80°C直至免疫测定。
[007引通过修改，使用市售的试剂盒（捷克共和国BioVendor公司）进行中期因子（MK) 夹屯、化ISA免疫测定。在200yLTBSTA(Tris-缓冲盐水，50mMTris-肥L，抑为8,0. 15M 化C1，0. 5%吐温20,1 %BSA)中稀释50yL甲状腺洗脱物。将100yL稀释的样品一式两份 转移到96孔板中，所述96孔板由生产商预先涂布抗中期因子的捕获抗体。将板在37°C下 不摇动解育2小时，然后用每个试剂盒中提供的洗漆缓冲液W每个孔0. 35mL来洗漆3次。 轻敲倒置的板W除去残余的液体后，将10yg/mL聚-k赖氨酸