出现了明 显的峰值，因此可以判断本实施例的待测样品中含有结核分支杆菌。本发明检测方法对结 核分枝杆菌具有很好的特异性。
[0029] 实施例2 (检测灵敏度实验）
[0030] 一、实验方法
[0031] 取结核分支杆菌菌体纯品，利用无菌水分别制备得到菌体浓度为lOcfu/mL、 102cfu/mL、103cfu/mL、104cfu/mL、10 5cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL、108cfu/mL 的菌液，而后 取同样体积的上述菌液作为待测样品分别执行以下检测。
[0032] 1)取待测样品加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀，得到待测物上清液待用。
[0033] 2)将上述上清液利用碳酸氢铵溶液溶解，加入苏糖醇于室温下孵育，而后加入碘 乙酰胺避光孵育，最后加入胰蛋白酶于37°C下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，得到酶解 产物。
[0034] 3)将步骤2)得到的酶解产物注入色谱-生物质谱联用系统检测，利用生物质谱 分析方法获得结核分枝杆菌标志性蛋白质片段NSGYIECCR的检测信号。实验结果如表1所 不。
[0035] 二、实验结果
[0036] 表1不同菌体浓度待测产物的检测结果
[0038] 如表1所示，利用本发明方法，浓度超过IO2CfVmL的待测样品都检测出了结核分 枝杆菌，表面本发明方法具有较强的灵敏性，能够对较低菌体含量的待测样品实现准确检 测，从而为疾病早发现、早治疗奠定了基础。
[0039] 实施例3
[0040] -种结核分枝杆菌检测方法，包括以下步骤：
[0041] 1)取待测样品利用罗氏培养基进行培养，收集全部培养物分别通过乙醇、氯 仿-甲醇溶液浸泡；收集固形物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液待用；
[0042] 2)检测步骤1)所述上清液中是否含有氨基酸序列为NSGYIECCR的结核分枝杆菌 标志性蛋白质片段。
[0043] 在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0044] 步骤2)所述检测是氨基酸序列测定。
[0045] 步骤2)包括以下步骤：对步骤1)得到的上清液进行胰酶酶解；而后通过生物质 谱分析酶解产物中是否含有序列为NSGYIECCR的结核分枝杆菌标志性蛋白质片段。
[0046] 步骤2)所述胰酶酶解包括以下步骤：将步骤1)得到的总蛋白溶解后加入二硫键 还原剂孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于35°C下孵育，将酶解后的蛋白脱 盐、干燥，即得到酶解产物。
[0047] 以上所述二硫键还原剂是苏糖醇。
[0048] 以上所述巯基封闭试剂是碘乙酰胺。
[0049] 实施例4
[0050] -种结核分枝杆菌检测方法，包括以下步骤：
[0051] 1)取待测样品利用罗氏培养基进行培养，收集全部培养物分别通过乙醇、氯 仿-甲醇溶液浸泡；收集固形物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液待用；
[0052] 2)检测步骤1)所述上清液中是否含有氨基酸序列为NSGYIECCR的结核分枝杆菌 标志性蛋白质片段。
[0053] 在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0054] 步骤2)包括以下步骤：对步骤1)得到的上清液进行胰酶酶解；而后通过生物质 谱分析酶解产物中是否含有序列为NSGYIECCR的结核分枝杆菌标志性蛋白质片段。
[0055] 步骤2)所述胰酶酶解包括以下步骤：将步骤1)得到的总蛋白溶解后加入二硫键 还原剂孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于39°C下孵育，将酶解后的蛋白脱 盐、干燥，即得到酶解产物。
[0056] 实施例5
[0057] -种结核分枝杆菌检测方法，包括以下步骤：
[0058] 1)取待测样品利用罗氏培养基进行培养，收集全部培养物分别通过乙醇、氯 仿-甲醇溶液浸泡；收集固形物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液待用；
[0059] 2)检测步骤1)所述上清液中是否含有氨基酸序列为NSGYIECCR的结核分枝杆菌 标志性蛋白质片段。
[0060] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种结核分枝杆菌检测方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 取待测样品利用罗氏培养基进行培养，收集全部培养物分别通过乙醇、氯仿-甲醇 溶液浸泡；收集固形物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液待用； 2) 检测步骤1)所述上清液中是否含有氨基酸序列为NSGYIECCR的结核分枝杆菌标志 性蛋白质片段。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤2)所述检测是氨基酸序列测定。3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于步骤2)包括以下步骤：对步骤1)得 到的上清液进行胰酶酶解；而后通过生物质谱分析酶解产物中是否含有序列为NSGYIECCR 的结核分枝杆菌标志性蛋白质片段。4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤2)所述胰酶酶解包括以下步骤： 将步骤1)得到的总蛋白溶解后加入二硫键还原剂孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入 胰蛋白酶于35~39°C下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述二硫键还原剂是苏糖醇。6. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述巯基封闭试剂是碘乙酰胺。
【专利摘要】本发明提供了一种结核分枝杆菌检测方法，该方法针对特定蛋白质分子标志物执行检测，该标志物本身特异性强、稳定性好、灵敏度高，不会因培养过程中其他菌种占据种群优势而影响检测结果。此外由于该标志物位于菌体本身而非其代谢产物，因此无论菌体处于何种生长阶段都不影响检测结果，具有较强的稳定性和指向性。相对于现有技术的培养法和涂片法而言，本发明准确性更高，且可通过标志物蛋白含量近似性的推算结核分枝杆菌含量，从而在一定程度上实现定量检测；相对于噬菌体扩增法而言，本发明方法步骤较为简便，操作时间短，且灵敏性相对较高，具备技术优势。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105181837
【申请号】CN201510553431
【发明人】程永娟
【申请人】程永娟
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月28日