)腺病毒10MOIs分别感染培养3天的原代屯、肌细胞， 12小时后用lyM血管紧张素II(AngII)(购自Sigma公司，A9525)或对照PBS刺激48 小时，然后进行免疫巧光试验。结果表明，AdshNulpl腺病毒感染后的屯、肌细胞表面面积 较AdshRNA对照组增加，而经AdNulpl腺病毒感染的屯、肌细胞表面面积则比对照组AdGFP 明显减少（图4)。即Nulpl的干扰腺病毒促进屯、肌细胞肥大，Nulpl的过表达腺病毒抑制屯、 肌细胞肥大。
[0059] 实施例5屯、肌肥厚模型小鼠屯、肌肥厚及纤维化检测和屯、功能检测 1.采用主动脉弓缩窄手术（AB)建立小鼠屯、肌肥厚模型 选用8-10周龄、体重在23. 5-27. 5g的野生型小鼠（WT)、Nulpl基因敲除小鼠 (Nulpl-KO)、屯、脏特异性Nulpl转基因小鼠（Nulpl-TG)及非转基因小鼠（NTG)各分成假手 术组（Sham)和AB术屯、肌肥厚模型组，即WTSiam组、WTAB组，Nulpl-KOSiam组、Nulpl-KO AB组，Nulpl-TGSiam组、Nulpl-TGAB组，NTGSiam组、NTGAB组，每组 10 只小鼠。造模 方法同实施例2。AB术后4周分别进行屯、肌肥厚及纤维化的检测和屯、功能的检测。
[0060] 2.取材 (1)前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10%甲醒的尿杯，并贴好标签(小鼠编号、 组别、手术类型及取材日期)。将倒满质量分数10%KC1溶液的培养皿置于取材处。打开分 析天平，调零备用。再称重处死小鼠。
[0061] (2)取材：眼科弯綴夹住屯、耳下方的血管蒂，剪下屯、脏，迅速置于质量分数10%KC1 溶液中。待屯、脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压屯、腔内液体，薩干表面液体后， 称重并记录，将屯、脏放入相应的尿杯中，固定4化后用于病理学检测。
[0062] (3)相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后 肢腔骨处皮肤，测量并记录腔骨长度。计算屯、重与体重的比值（册/BW)，肺重与体重的比值 (LW/BW)W及屯、重与腔骨长度的比值（册AL)。
[0063] 3.病理学检测 3. 1制备石蜡标本切片 主要操作程序包括修剪屯、脏一包埋框处理一流水冲洗一脱水一透明一浸蜡一包埋一 切片一摊片一惊干或烘烤后备用。
[0064] 3. 2苏木精-伊红（肥）染色 主要步骤为：取石蜡标本切片55°C烘烤30min-二甲苯5min，3次一 100%酒精Imin- 95%酒精Imin- 70%酒精Imin-双蒸水Imin-苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021) 5min-水洗Imin- 1%盐酸酒精（取3血浓盐酸与297血70%酒精充分混合均匀）l-3s- 水洗Imin-Scott液(碳酸氨钢0. 35g，屯水硫酸儀2g，两者溶于100血蒸馈水)lmin-水 洗Imin-伊红溶液(珠海贝索，BA-4024) 3-5min-蒸馈水洗去浮色一 70%酒精Is- 95% 酒精Is- 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通风楓内吹 干，显微镜拍照。
[0065] 肥染色图片统计：每张图片选择3个W上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用 Image-ProPlus6.0软件圈细胞面积。
[0066] 3. 3麦胚凝聚素（WGA)染色 主要步骤：将经60°C烘烤30min的石蜡标本切片置于二甲苯5minX3次一 100%乙 醇5minX2次一 95%乙醇5min- 70%乙醇5min-蒸馈水漂洗5minX2次一PBS漂洗 5min-PBS漂洗lOmin-弃去PBS，滴加膜酶工作液（DIG-3008,福州迈新）37°C避光解育 20min-PBS漂洗5minX3次一取出切片，用滤纸擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，用 组化笔划圈平放于湿盒中一滴加WGA-AlexaFlour488工作液（10yg/mL)37°C避光解育 化一弃去染液，PBS漂洗 5minX3 次一SlowFadeGoldantifadereagentwithDAPI封 片一巧光镜下观察，显微镜拍照。
[0067] 3. 4天狼星红（PSR)染色 主要步骤为：取石蜡标本切片55°C烘烤30min-二甲苯2min，3次一 100%酒精Imin- 95%酒精Imin- 70%酒精Imin-流水冲洗lOmin-双蒸水Imin-质量分数0. 2%憐 钢酸2min- 0. 1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min-去除残液一 0. 01N 盐酸4s- 70%酒精1次一 90%酒精1次一 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二 甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。
[006引 PSR染色图片统计（Image-ProPlus6.0软件):胶原比例=胶原面积/(总面积-空 白面积）X1000/0。
[0069] 屯、肌组织由屯、肌细胞和间质组织组成，屯、脏是一终末分化器官，屯、肌细胞失去增 殖能力，各种生理或病理性刺激引起的屯、肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能 在数量上增殖。因此，在屯、肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为屯、肌细胞体积增大，肌节 数量增多，细胞排列素乱，屯、脏间质改变包括屯、肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度 增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。
[0070]WT及Nulpl-KO小鼠采用AB术建立屯、肌肥厚模型后的表型结果见图5-7。化am (假手术）组中WT及Nulpl-KO小鼠的册/BW、LW/BW及册AL之间的差异均无统计学意义；WT小鼠AB术后4周的册/BW、LW/BW、册AL高于其Siam组；AB术后4周，Nulpl-KO小鼠 的册/BW、LW/BW及册AL均较WT小鼠上升姻5)。肥染色及WGA染色切片可观察到：化am 组屯、脏无明显差异，AB组较化am组的屯、脏均增大，NULP1-K0小鼠的屯、脏明显大于WT组 小鼠；化am组屯、肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组肌 丝排列素乱、松散，屯、肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、崎形，核仁模糊， Nulpl-KO组则比WT组细胞肥大明显，差异有统计学意义（图6)。PSR染色后，发现AB组屯、 室屯、肌间质胶原含量较化am组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排列素 乱成网络状；Nulpl-KO小鼠AB术后屯、肌间质胶原含量及血管周围胶原含量则比WT小鼠AB 术后增加较多（图7)。W上结果说明经AB术建模后，小鼠发生明显的屯、肌肥厚，Nulpl-KO 小鼠的屯、肌肥厚及纤维化程度大于WT小鼠。
[007。图9-11是NTG和Nulpl-TG小鼠采用AB术建立屯、肌肥厚模型后的表型结果。同 样AB术后4周TG小鼠的册/BW、LW/BW及册/化增大的程度明显小于NTG小鼠姻9)。肥 染色及WGA染色切片可观察到：AB术后TG小鼠屯、脏增大的程度远小于NTG小鼠；TG小鼠 AB术后屯、肌细胞横截面积显著小于NTG小鼠AB组（图10)。PSR染色可见，TG小鼠AB术后 屯、肌间质胶原含量及血管周围胶原含量小于NTG小鼠AB组（图11)。W上结果说明经AB术 建模后，小鼠发生明显的屯、肌肥厚，Nulpl-TG小鼠的屯、肌肥厚及纤维化程度小于NTG小鼠。
[0072] 4.超声检测屯、功能 4. 1前期准备 (1)麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再梓开麻醉机上加药口密封 盖，迅速加入异氣烧至安全刻度后梓紧密封盖。梓开氧气瓶上总阀口，调整流量控制阀的旋 钮，出气压力维持在0. 2-〇. 3mPa。
[0073] (2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氣烧迅速麻醉后，左胸前区剌毛，将处理好的 小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，W1. 5-2. 0%异氣烧维持小鼠稳定的麻醉状态。
[0074] 4. 2屯、功能检测 小鼠取左侧邸位或仰邸位，并在剌毛区均匀涂抹超声禪合剂(天津成信公司）。采用 高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左屯、室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径 (LVEDd)、射血分数（EF)及短轴缩短率（FS)。
[007引图8是WT和Nulpl-KO小鼠采用AB术建立屯、肌肥厚模型后的屯、功能检测结果。与WT化am组相比，WT小鼠AB术后4周表现出屯、功能减弱和屯、肌肥厚，主要表现为屯、肌肥厚 的指标LVEDd增加，而反映屯、功能的指标EF、FS则下降。AB术后4周，Nulpl-KO小鼠屯、肌 肥厚的指标增大的程度及反映屯、功能的指标下降的程度大于WT小鼠（图8)。
[0076] 图12是NTG和Nulpl-TG小鼠采用AB术建立屯、肌肥厚模型后的屯、功能检测结果。 AB术后4周，与NTG小鼠相比，TG小鼠屯、肌肥厚的指标增大的程度及反映屯、功能的指标下 降的程度则小于NTG组（图12)。
[0077] 由W上结果可知，在主动脉弓缩窄引起的屯、肌肥厚疾病模型中，Nulpl基因缺陷 显著促进了屯、肌肥厚、纤维化，恶化屯、功能，Nulpl基因过表达显著抑制了屯、肌肥厚、纤维 化，保护屯、功能。因此Nulpl基因具有保护屯、功能和抑制屯、肌肥厚及纤维化的作用，特别是 Nulpl基因具有能够抑制主动脉弓缩窄引起的屯、肌肥厚相关疾病发生的作用。
[0078] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 核定位蛋白1在筛选保护心脏功能的药物中的应用。2. 核定位蛋白1在制备保护心脏功能的药物中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：包括核定位蛋白1作为保护心脏功能的 药物的有效成分，能够促进核定位蛋白1表达的化学物质作为保护心脏功能的药物的有效 成分。4. 核定位蛋白1在筛选抗心脏纤维化的药物中的应用。5. 核定位蛋白1在制备抗心脏纤维化的药物中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：包括核定位蛋白1作为抗心脏纤维化的 药物的有效成分，能够促进核定位蛋白1表达的化学物质作为抗心脏纤维化的药物的有效 成分。7. 核定位蛋白1在筛选预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用。8. 核定位蛋白1在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：包括核定位蛋白1作为预防、缓解和/或 治疗心肌肥厚的药物的有效成分，能够促进核定位蛋白1表达的化学物质作为预防、缓解 和/或治疗心肌肥厚的药物的有效成分。
【专利摘要】本发明公开了一种核定位蛋白1（Nulp1）在治疗心肌肥厚中的功能及应用，属于基因的功能与应用领域。本发明确定了Nulp1的表达与心肌肥厚之间的相互关系，研究结果表明在发生心肌肥厚的模型中，Nulp1的表达和正常组相比显著降低；抑制Nulp1表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，促进Nulp1过表达则显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此，Nulp1可作为靶基因，用于筛选保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，用于制备保护心脏功能、抗心肌肥厚和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。
【IPC分类】A61K38/17, A61P9/04, G01N33/68, A61K45/00, A61P9/00
【公开号】CN105181975
【申请号】CN201510633704
【发明人】李红良, 王丕晓, 张晓晶
【申请人】武汉大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月29日