【附图说明】
[0028] 图1为本发明所制备试剂盒的灵敏度。
[0029] 图2为本发明所制备试剂盒的线性图。
[0030] 图3是位本发明所制备试剂盒与酶联免疫法试剂盒检测临床样本比对的相关性 比较。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1 :亲和纯化制备羊抗人GPI多克隆抗体
[0032] 羊抗人GPI多克隆抗体的制备：
[0033] 取健康免疫动物，用GPI抗原进行免疫，第一次以抗原加卡介苗和福氏佐剂研匀， 注射动物颈淋巴结和皮下肌肉组织，每两周一次，共免疫4-5次，抗原量根据动物的体重增 减，免疫最后一次的二周后采血，动物抗人血清用饱和硫酸铵二级沉淀初步分离抗体。
[0034] 羊抗人多克隆抗体的纯化：
[0035] 首先，制备亲和纯化所用的分离柱：将IOmg高度纯化的GPI抗原固定在HITRAP NHS-活性HP柱（来自AmershamPharmaciaBiotech)上；
[0036] 其次，上样及洗脱：将初步分离的血清在磷酸盐缓冲液中稀释至2mg/ml，将200ml 的血清稀释液流过柱子，然后用50ml的磷酸盐缓冲液洗冲洗柱子，再用35ml的洗脱液洗脱 对GPI具有特异亲和力的抗体；
[0037] 然后，透析纯化：将上述洗脱的特异性抗GPI抗体用另算呀缓冲液透析，并且使用 AmiconCentricon离心过滤装置浓缩至3mg/ml，即为亲和纯化的羊抗人GPI多克隆抗体。
[0038] 实施例2 :制备GPIR2试剂
[0039] 过程分三步：抗体交联、胶乳清洗、胶乳悬浮
[0040] 抗体交联：将0? 5mg上述制备的抗体用5ml0?IM磷酸盐缓冲液（pH7. 8)稀释后， 加入表面修饰羧基，直径120nm的聚苯乙烯胶乳溶液（来自JSR)，再加入5mgEDAC，在37°C 反应6小时，加入0. 5ml0.IM甘氨酸缓冲液（pH8. 5)搅拌1小时终止反应。
[0041] 胶乳清洗：离心去掉上清以清除多余的抗体、交联剂及交联反应的副产物等，底部 沉淀即为包被好的胶乳。用20ml的50mM的甘氨酸缓-NaOH缓冲液洗涤3次。
[0042] 胶乳悬浮：将20ml同样的甘氨酸-NaOH缓冲液加入到上述沉淀，超声波处理 4min，混匀得均已的乳白色胶乳悬浮液，即为R2试剂。
[0043] 其中，甘氨酸-NaOH缓冲液中含有0. 9%氯化钠、0. 5%EDTA、0. 8%BSA、0. 1%吐温 20、0. 1 %叠氮钠，保证胶乳颗粒处于均一稳定的悬浮状态。
[0044] 实施例3 :制备GPIRl试剂
[0045] 在50mMpH7. 2的TRIS-HCL缓冲液中，添加0? 9 %氯化钠、0? 2 %吐温20、5 % PEG-6000、0. 2%BSA、0? 5%EDTA、0. 1% 叠氮钠，搅拌均匀即为Rl试剂。
[0046] 实施例4 :制备GPI校准品
[0047] 在ph7. 2、含有50mMTRIS-HCL缓冲物的预处理人血清基质中，加入浓度分别为0、 20. 625、41.25、82. 5、165、330ng/ml的GPI抗原纯品，搅拌均匀，作为GPI多点校准品。此 外，预处理的人血清基质中还包含0.9%氯化钠、1%834、0.75%￡01六、0.1%叠氮钠。
[0048] 实施例5 :GPI试剂盒的性能检测
[0049] 1、检测试剂盒的用法：
[0050] 以日立7080生化分析仪为例：测定波长为570nm，首先加入Rl试剂150ul，37°C 反应30秒，其后加入GPI校准品3ul，再反应60秒，其后加入R2试剂50ul，测定反应第10 秒、70秒的吸光度值A1、A2,计算吸光度差值SA=A2-A1。每管重复测定2次。将各校准 品2次测得的吸光度差值为纵坐标，对应浓度为横坐标，制作"浓度-吸光度差值"校准曲 线。取待测样本，同法测定样本的吸光度差值，将其代入校准曲线，即可计算得出待测样本 中的GPI含量。
[0051] 2、灵敏度检测：
[0052] 以生理盐水为空白样本，稀释人血清样本，配制浓度分别为2、4、6、8、10ng/ml的 样本，用上述GPIRUGPIR2和GPI校准品组成的试剂盒，按照1所述的方法测定10次， 计算吸光度均值和标准差（SD)，以样本吸光度-2. 6SD大于空白吸光度+2. 6SD的样本浓度 作为GPI检测试剂盒的灵敏度范围，见图1.如下表1所示，本发明试剂盒的灵敏度能达到 2ng/ml〇
[0053] 表1.本发明试剂盒灵敏度检测
[0054]
[0055] 3、线性范围检测：
[0056] 筛选GPI浓度约为lOOOng/ml的样本，用生理盐水做10个不同比例的稀释，按照1 所述的方法检测各浓度，每个浓度的样本重复测定3次，将测定浓度的平均值与理论浓度 进行回收率分析，结果显示偏差小鱼10% (见表2)，证明线性能达到1000ng/ml，见图2.
[0057] 表2.本发明试剂盒线性范围
[0058]
[0059] 4、本发明试剂盒与双抗体夹心法试剂盒检测临床样本的相关性比较
[0060] 相关性实验所用的ELISA法试剂盒用纯化的抗体包被微孔板制成固相抗体，向包 被单抗的微孔中依次加入GPI、生物素化的抗人GPI抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤 后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的 黄色。颜色的深浅和样品中的GPI呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值（0D 值）。用本发明的试剂盒与对照试剂盒对80例病人样本同时进行检测，检测结果见附图3， 以对照试剂盒检测样本的结果为横坐标，以本发明试剂盒检测结果为纵坐标作回归分析， 相关方程为Y=I. 0043X-0. 6272,相关系数为R2= 0. 999,经过统计学处理结果表明，本方 法同ELISA法试剂盒对于临床样本测纸的相关性良好。
[0061] 以上实施例是对本发明的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明 的精神和权利保护范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种胶乳增强免疫比浊法测定人GPI含量的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括GPI Rl试剂、GPIR2试剂和GPI校准品； 所述GPIRl试剂包含电解质、促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液； 所述GPIR2试剂包含抗人GPI多克隆抗体包被胶乳颗粒、电解质、稳定剂、表面活性 剂、防腐剂及缓冲液； 所述GPI校准品包含防腐剂、电解质、稳定剂、GPI抗原及缓冲液。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：其中抗人GPI多克隆抗体选自绵羊或 兔子等健康的免疫动物。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：其中抗人GPI多克隆抗体通过使用人 GPI抗原亲和纯化而获得。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：其中胶乳颗粒为直径60-300nm、浓度为 0.l_5mg/ml的聚苯乙稀胶乳颗粒，直径80_140nm。5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：其中胶乳颗粒表面由功能团修饰，该功 能团选自羧基、氨基、羟基、酰肼或氯甲基。6. 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：其中抗体包被胶乳颗粒是通过化学交 联剂在交联缓冲液中进行的，所用的化学交联剂选自碳化亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟 基硫代琥珀酰亚胺、酰肼、异氰酸酯或其组合：交联缓冲液选自不含氨基的缓冲液，MES、 MOPSO、MOPS、HEPES、磷酸盐缓冲液，pH在 6. 0-8. 0 之间。7. 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于： 所述GPIRl试剂包含占其质量百分比为：0. 1% -5.0%电解质、2% -6%促凝剂、 0. 1% -1%稳定剂、0. 1% -1.0%表面活性剂、0.05% -0. 1%防腐剂及pH7-9、浓度范围为 10-lOOmmol/L的缓冲液； 所述GPIR2试剂包含抗人GPI多克隆抗体包被胶乳颗粒，还包含占其质量百分比为： 0? 1% -5. 0%电解质、0? 5% -5%稳定剂、0? 1%-L0%表面活性剂、0? 05% -0? 1%防腐剂及 PH7-9、浓度范围为10-100mm〇l/L的缓冲液； 所述GPI校准品包含占其质量百分比为：0. 1% -5.0%电解质、0.5% -5%稳定剂、 0. 05% -0. 1%防腐剂、0-330ng/mlGPI抗原及溶解在预处理的人血清基质中、pH6. 5-8. 0、 浓度为10-100mm〇l/L的缓冲液。8. 根据权利要求1或7所述的试剂盒，其特征在于：其中所述的电解质选自无机盐类。9. 根据权利要求1或7所述的试剂盒，其特征在于：其中所述稳定剂选自牛血清白蛋 白、酪蛋白、鱼皮明胶蛋白、葡萄糖、果糖、甘露醇、壳聚糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠或其 组合。10. 根据权利要求1或7所述的试剂盒，其特征在于：其中所述促凝剂选自PEG-4000、 PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖钠。
【专利摘要】本发明涉及一种胶乳增强免疫比浊法测定人GPI(葡萄糖6磷酸异构酶，Glucose-6-phosphateisomerase)含量的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括GPI？R1试剂、GPI？R2试剂和GPI校准品，其中GPI？R1试剂包含电解质、促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液；GPI？R2试剂包含抗人GPI多克隆抗体包被胶乳颗粒、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液；GPI校准品包含防腐剂、电解质、稳定剂、GPI抗原及缓冲液。本试剂盒特异性强、灵明度高、均一稳定、快速简便，可用于各种生化分析仪。
【IPC分类】G01N33/573
【公开号】CN105223356
【申请号】CN201510681623
【发明人】朱钰峰, 周亚萍, 曹利民
【申请人】常州英赞美科生物科技有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月20日