M CaCl2)中。
[0014] (6)利用Au-S键的作用将金纳米棒与巯基化赭曲霉毒素A适配体互补寡核苷酸链 连接。取lmL金纳米棒溶液，加入一定量的巯基化0ΤΑ适配体寡核苷酸链，25°C摇床下孵育 16h，离心收集材料和上清，用BB缓冲液清洗三次，分散于BB缓冲液中，4°C储存备用。
[0015] (7)通过赭曲霉毒素A适配体DNA与其互补DNA单链的杂交，将上转换发光纳米颗 粒与金纳米棒连接起来构成一个纳米复合物，发生发光共振能量转移，实现上转换发光信 号的淬灭。具体方法为：取0. 5mgmLΑΤΑ适配体标记的上转换发光纳米颗粒溶液与60pM 0ΤΑ适配体寡核苷酸单链功能化的金纳米棒混合，在BB缓冲液体系中37°C反应70min，形成 上转换纳米颗粒与金纳米棒纳米复合物。
[0016] (8)对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线。配制不同浓度的赭曲霉毒素 A标准品加入到纳米复合物体系中，37°C孵育80min，在980nm激光激发下得到657nm处的 上转换发光信号，空白组检测得到的淬灭发光信号（U最小，随着赭曲霉毒素A浓度的增 加发光信号（I)逐步增加。根据发光差值（ΛI=I-IJ与对应的赭曲霉毒素A标准品浓 度建立标准曲线，实验结果在0.05-100ng/mL区间内得到良好线性关系。
[0017] (9)对赭曲霉毒素A样品进行检测：对样品做简单的处理，随后直接加入到上述纳 米复合物体系中37°C孵育80min后，直接在980nm激光下激发得到657nm处的上转换发光 信号，从标准曲线中求得对应的赭曲霉毒素A的浓度。
[0018] 本发明的优点是：
[0019] (1)利用适配体对被检测物质实现特异性捕获，有效提高了检测的稳定性和准确 性。
[0020] (2)利用适配体与抗体相比较，具有可人工合成，不依赖动物和细胞，周期短、成本 低、批次间差异小，便于化学修饰，稳定性也好，可长期保存。
[0021] (3)利用激光诱导上转换发光，检测背景低大大提高了检测的灵敏度。
[0022] (4)利用可调控纵向表面等离子体共振吸收峰的金纳米棒对上转换发光纳米材料 实现发光共振能量转移，可以应用于不同发光光谱的上转换纳米材料，而且分析检测过程 不需要进行分离，属于均相检测，大大简化了分析检测过程。
【附图说明】
[0023] 图1 :基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒 素A的实验原理图
[0024] 图2 :NaYF4:YbQ.2S6,ErQ._上转换发光纳米材料电镜图（a);聚丙烯酸修饰 NaYF4:YbQ.2S6,ErQ.Q2S6上转换发光纳米材料电镜图（b)
[0025] 图3:金纳米棒电镜图
[0026] 图4:金纳米棒紫外吸收图（a) ;NaYF4:Yba2，Era(]2S6上转换发光纳米颗粒发光光谱 (b)
[0027] 图5:上转换发光强度随赭曲霉毒素A变化叠加图（a);赭曲霉毒素A检测标准曲 线图（b)，浓度范围在0.05-100ng/mL。
[0028] 图6:本发明和ELISA方法检测同样的实际样品得到的相关性曲线。
【具体实施方式】
[0029] 本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同 替换或者局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
[0030] 实施例1:啤酒实际样品中赭曲霉毒素A检测标准曲线建立及检测样品预处理：啤 酒样品置于4°C冰箱冷藏30min，超声脱气。取脱气后啤酒样品20g，置于25mL容量瓶中， 加2%碳酸氢钠和15%氯化钠混合提取液至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至澄清，收集 滤液备用。
[0031] 从本地超市购买5中不同类别的啤酒，利用本发明方法和酶联免疫方法分别测定 其中赭曲霉毒素A的含量，结果见表一。两种方法检测结果一致，无明显差异。
[0032] 表一：啤酒实际样品检测，本发明方法与Elisa方法对比
[0033]
[0034] 注：ND为未检出
[0035] 实施例2:啤酒实际样品中赭曲霉毒素A的检测及加标回收率实验样品预处理同 实施例1。
[0036] 以实施例1得到的5组赭曲霉毒素A浓度数据为本底值，分别向其中加入五种不 同浓度的0ΤΑ标准品，同样利用本发明方法再次检测其中0ΤΑ的含量，得到检测值。回收 率％ =(检测值-本底值）/添加量X100 %。从表二数据可以看到回收率在93. 4%~119 %， 说明本发明稳定，灵敏，准确，适用于啤酒实际样品中0ΤΑ的检测。
[0037] 表二：啤酒实际样品中赭曲霉毒素A的检测及加标回收率
[0038]
[0039] 实施例3:小麦实际样品中赭曲霉毒素A检测标准曲线建立及检测样品预处理
[0040] 将小麦研磨，硬质的粮食等用高速万能粉碎机磨细并通过1mm孔径试验筛，不要 磨成粉末。称取20g(精确到0.Olg)磨碎的小麦试样于100mL容量瓶中，加入5g氯化钠， 加80%甲醇提取液至刻度，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，移 取10.OmL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清， 收集滤液A于干净的容器中。
[0041] 从本地超市购买9种不同种类的小麦，利用本发明方法和酶联免疫方法分别测定 其中赭曲霉毒素A的含量，结果见表三。两种方法检测结果一致，无明显差异。可用于小麦 实际样品赫曲霉毒素A检测。
[0042] 表三：小麦实际样品检测，本发明方法与Elisa方法对比
[0043]
[0044]
【主权项】
1. 一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒素 A的方法，其特征在于：将赭曲霉毒素A适配体与NaYF4:Yba2S6,Era_上转换发光纳米材 料偶联形成能量供体探针，同时巯基化赭曲霉毒素A适配体互补寡核苷酸单链与金纳米棒 (纵横比为2. 5左右）连接形成能量受体探针，通过双链杂交形成上转换-金纳米棒纳米复 合物，使得能量供体探针与能量受体探针两者之间的距离拉近，发生发光共振能量转移现 象（LRET)，实现发光信号淬灭。利用980nm激光激发纳米复合物，记录此时的发光发射峰强 度，在检测体系中加入赭曲霉毒素A，由于赭曲霉毒素A会优先与对应的适配体结合并改变 适配体的空间构象导致互补链与适配体解离，从而使一部分上转换-纳米棒纳米复合物分 解，利用980nm激发收集此时的上转换发光信号。在一定范围内，赭曲霉毒素A的数量与上 转换发光信号恢复呈正相关，对照657nm的发光峰发光信号恢复强度建立标准曲线，以达 到对赫曲霉毒素A定量检测的目的。2. 如权利要求1所述的一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量 转移检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：合成NaYF4:Yba2S6,EraQ2S6上转换发光纳米材 料和纵横比为2. 5左右的金纳米棒应用于赭曲霉毒素A的检测。3. 如权利要求1所述的一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量 转移检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：赭曲霉毒素A适配体与上转换发光纳米材料偶 联形成能量供体探针，巯基化赭曲霉毒素A适配体互补寡核苷酸链与金纳米棒偶联形成能 量供体探针。4. 如权利要求1所述的一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量 转移检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：利用EDC/NHS作为偶联剂连接聚丙烯酸修饰的 上转换发光纳米材料和生物素化（Biotin)赭曲霉毒素A适配体，利用Au-S键连接纵横比 为2. 5的金纳米棒和巯基化赭曲霉毒素A适配体的互补寡核苷酸单链。5. 如权利要求1所述的一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量 转移检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：赭曲霉毒素A的适配体序列为：5'-Biotin-GAT CGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'，赭曲霉毒素A适配体的互补寡核苷酸 单链序列为：5' -SH-C6-CGATGCTAACTT-3'。6. 如权利要求1所述的一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量 转移检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：所述方法能够用于啤酒、小麦及其制品中赭曲 霉毒素A的检测。
【专利摘要】一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒素A的方法，用于小麦及其制品等中赭曲霉毒素A(OTA)含量的检测。通过将上转换发光材料(NaYF4:Yb0.286,Er0.0286)与赭曲霉毒素A核酸适配体连接形成能量供体探针，再通过碱基互补配对原则与适配体互补寡核苷酸单链修饰的金纳米棒(纵横比为2.5左右)能量受体探针形成纳米复合物，发生发光共振能量转移现象(LRET)，达到上转换发光淬灭的目的。当检测体系中存在OTA时，OTA与OTA适配体特异性结合，从而使双链解链，通过监控657nm处的上转换发光信号强度，能够定量检测OTA，线性范围为0.05-100ng/mL，检出限为0.027ng/mL。本发明用于OTA检测具有灵敏度高、快速简便的优点。并应用于啤酒、小麦样品的检测，结果准确可靠。
【IPC分类】G01N21/63
【公开号】CN105372213
【申请号】CN201510633405
【发明人】吴世嘉, 戴邵亮, 王周平, 段诺
【申请人】江南大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年9月29日