，从而构建 出荧光传感速度和蛋白浓度的标准曲线（图3-B)。构建出标准曲线后即可用相同方法对未 知浓度的IgG进行测定，测定出未知浓度IgG的荧光传感速度后就可以根据其荧光传感速度 和标准曲线计算出其浓度值，
[0032]本实施例具体包括如下步骤：
[0033]第一步，以定量测定卵清蛋白浓度为例。本实施例中选择5个浓度点，为0.2、0.5、 1、2、5mg/mL。在玻璃电泳管中配置成凝胶溶液。
[0034]所述的凝胶采用聚丙烯酰胺凝胶，其浓度为10.0%到20.0% (w/v%)，交联度为 3.0%到6.0%，其背景电解质溶液采用20mM pH 7.4磷酸盐缓冲溶液。
[0035]所述的凝胶中优选含有催化剂四甲基乙二胺以及引发剂过硫酸铵。
[0036] 第二步，如图2所示，通过FSS-CSE方式进行检测:在毛细管靠近阴极端注入Fl@Rp3 探针后，施加66.7V/cm的电场，在电场作用下，Fl@Rp3探针向阳极移动，当Fl@Rp3遇到固定 在凝胶中的糖蛋白后，Rp3与糖蛋白共价结合从而释放出游离的荧光分子F1，达到荧光传感 的目的（图3-A)。释放出来的F1在电场下的迀移速率与凝胶中糖蛋白的浓度有关，糖蛋白浓 度越大，迀移速率越快。
[0037] 如图1所示，所述的Fl@Rp3探针通过以下方式得到：将40mM F1溶液和40mM Rp3溶 液等体积混合后即可得到20mM Fl@Rp3探针溶液。反应方程式为：[FI] + [Rp3]< >[Fli Rp3];其中Rp3合成具体步骤如下:将0.29g(2.Ommol)α-萘酚和〇. 15g(l.Ommol)3-甲醛基苯 硼酸溶于lmL硫酸中。该混合物在室温下搅拌10h后加入10mL甲醛，出现深棕色固体，过滤处 理。最后将深棕色固体置于二甲基甲酰胺-甲苯溶液中结晶纯化得到〇.32g橙色固体，该固 体即为Rp3。
[0038]由于F1与Rp3依赖于库仑力形成Fl@Rp3,其中F1为焚光素，在360nm激发波长下发 出绿色荧光，而合成的Rp3则是一种荧光猝灭剂。F1与Rp3结合形成Fl@Rp3后，荧光猝灭。当 Fl@Rp3复合探针遇到糖/糖蛋白后，Rp3结构上的硼酸基会与糖/糖蛋白的二羟基共价结合 形成一个五元环，同时F1被重新释放出来，发出荧光。
[0039]上述的FSS-CSE检测中，电极缓冲液采用20mM pH 7.4磷酸盐缓冲溶液。
[0040] 所述的电场为66.7V/cm。
[0041 ]第三步，由于荧光传感可视，以此测得FSS迀移速度，计算出xQva，从而得到标准曲 线y〇va = axQva+b，本实施例中 a为 5.135X10-4，b为0.1475。
[0042] 第四步，用第二步的相同方法重新测定未知浓度的卵清蛋白样品，得到对应的荧 光传感速度X，将荧光传感速度X代入第三步中的标准曲线计算出卵清蛋白样品的浓度。 实施例2
[0043] 本实施例将实施例1中的卵清蛋白替换为与糖尿病检测相关的糖化血红蛋白 (HbAlc)，同样的可以得到一条标准曲线，如图3C所示。使用上述相同的方法可求得人血中 糖化血红蛋白的含量。
[0044] 所述的凝胶同样为聚丙烯酰胺凝胶，浓度，交联度和组分与卵清蛋白FSS-CSE测试 中的凝胶一致。
[0045] 所述的背景电解质溶液和电极缓冲液均为20mM pH 7.4磷酸盐缓冲溶液。
[0046] 上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同 的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所 限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
【主权项】
1. 一种定量检测糖基化蛋白的巧光速度传感方法，其特征在于，W糖基化蛋白标准品 进行巧光速度传感-忍片超分子电泳测试，获得不同浓度糖基化蛋白与巧光传感棚酸探针 结合后释放出的巧光素在电场下的对应不同迁移速率，构建出已知浓度糖基化蛋白与巧光 素迁移速率之间的线性关系；然后采用相同的检测操作和检测条件利用巧光速度传感-忍 片超分子电泳测试未知浓度糖基化蛋白，获得对应的巧光素在电场下的迁移速率，带入线 性关系获得该糖基化蛋白的浓度。2. 根据权利要求1所述的定量检测糖基化蛋白的巧光速度传感方法，其特征是，所述的 糖基蛋白包括:免疫球蛋白G、卵清蛋白及糖化血红蛋白。3. 根据权利要求1所述的定量检测糖基化蛋白的巧光速度传感方法，其特征是，所述的 线性关系是指:糖基化蛋白浓度XGP与巧光素迁移速率y之间的线性关系，即：yGP = axGP+b，其 中:a和b均为针对不同类型的糖蛋白的常数。4. 根据权利要求1所述的定量检测糖基化蛋白的巧光速度传感方法，其特征是，所述的 糖蛋白标准品是指:浓度和种类已知的糖基化蛋白，浓度分别为0.2、0.5、1、2和5mg/mL。5. 根据权利要求1所述的定量检测糖基化蛋白的巧光速度传感方法，其特征是，所述的 巧光传感棚酸探针Fl@Rp3是指:40mM Fl巧光素和40mM棚酸探针化3等体积混合所得到的20mM Fl@Rp3溶液，其中：F1巧光素的化学结构为： 棚酸探针的, 化学结构为：6. 根据权利要求1所述的定量检测糖基化蛋白的巧光速度传感方法，其特征是，所述的 巧光速度传感-忍片超分子电泳测试中施加的电场为66.7V/cm，采用的凝胶为聚丙締酷胺 凝胶，背景电解质溶液和电极缓冲溶液采用憐酸盐缓冲溶液。7. 根据权利要求6所述的定量检测糖基化蛋白的巧光速度传感方法，其特征是，所述的 聚丙締酷胺凝胶，重量体积浓度为15%，交联度为4%。8. 根据权利要求6所述的定量检测糖基化蛋白的巧光速度传感方法，其特征是，所述的 电极缓冲液的离子强度和凝胶中的背景电解质溶液的离子强度相同，均为20mM pH 7.4。9. 根据权利要求1所述的定量检测糖基化蛋白的巧光速度传感方法，其特征是，所述的 巧光速度传感-忍片超分子电泳测试，包括W下步骤： i)将样品与聚丙締酷胺凝胶一起灌注到毛细管中进行凝胶处理，然后在每根毛细管一 端注入巧光传感棚酸探针后，将毛细管依次陈列到忍片超分子电泳装置中，且上样端置于 电泳装置的阴极端； ii)将忍片超分子电泳装置置于巧光显微镜下，施加电场后，通过光学设备捕获释放出 的Fl，并生成一系列巧光成像图片，再通过图像处理得到Fl在电场下的平均迁移速率。
【专利摘要】一种定量检测糖基化蛋白的荧光速度传感方法，以糖基化蛋白标准品进行FSS-CSE测试，获得不同浓度糖基化蛋白与荧光传感硼酸探针F1Rp3结合后释放出的荧光素在电场下的对应不同迁移速率，构建出已知浓度糖基化蛋白与荧光素迁移速率之间的线性关系；然后采用相同的FSS-CSE测试未知浓度糖基化蛋白，获得对应的荧光素在电场下的迁移速率，带入线性关系获得该糖基化蛋白的浓度。本发明能够有效地检测糖蛋白的浓度的同时能对血液中的糖化血红蛋白(HbA1c)进行快速定量的测定，此外，本发明检测速度快，测定糖蛋白的浓度只需半小时。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105510294
【申请号】CN201610054792
【发明人】曹成喜, 吴雪静, 孟庆华, 樊柳荫, 肖华, 丛峰松
【申请人】上海交通大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月27日