那霉素，纯度大 于94.5 % ;壮观霉素，纯度大于95.5 % ;庆大霉素，纯度大于90 %。以上标准品均购自美国 Dr.公司。
[0048] 实施例1:鱼肉中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素残留量的检 测
[0049] (1)样品前处理
[0050]提取：
[0051 ]打碎后的样品称3g至50ml离心管中，加入10ml提取液，均质、混匀、离心，上清液转 移至另一新的50ml离心管中，在提取液中加入10ml正已烧，振荡混勾15min，离心，弃去上层 液体，取下层提取液l〇ml过柱净化。
[0052]净化：
[0053] SPE柱净化，提前用5ml甲醇、5ml水预柱，10ml提取液加贮液器中以小于等于3ml/ min的流速通过C18柱，待液体完全流出后，用5ml水淋洗小柱，弃去所有流出液，正压吹干， 最后用3ml甲醇洗脱，收集洗脱液至10ml氮吹管，50°C水浴氮气吹干，1.0ml流动相定溶过 0.22μπι滤膜至进样小瓶，供高效液相色谱一串联质谱仪测定。
[0054] (2)标准工作溶液的配制
[0055] 称取标准品10±0.Olmg于10mL塑料容量瓶中，用纯水溶解，定容得1000.Oyg/mL标 准储备液;移取链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素标准储备液各1. OmL置 于1 OOmL塑料容量瓶中，用纯水定容得到10.0 yg/mL混合标准中间液；
[0056]用经检测不含链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素的鱼肉作为空 白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将混合标准中间液用空白基质溶液稀释 配制成50、100、200、500、1000ng/mL系列基质标准工作溶液，待分析。
[0057] (3)液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定
[0058]将不同浓度梯度的标准工作液分别注入LC-MS/MS，以外标法进定量分析，即以标 准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线;在相同条件下将样品 提取液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样 品液中目标物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中目标物残留量。 [0059] 色谱条件：
[0060]色谱柱:0beliSCR 2.1X150mm，5ym Lot:S02-002C;流动相：（A)乙腈；（B)l% 甲酸
[0062] 水溶液(含lOmM甲酸铵）；流速:0.5mL/min;进样量:10yL;柱温:30°C;梯度洗脱程序如表1。[0061] 表1:实施例1的梯度洗脱程序
[0063]
[0064]质谱参数：
[0065]离子源：电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多重反应监测(MRM);电 喷雾电压:5500V;雾化气压力:0 · 344MPa;气帘气压力:0 · 172MPa;辅助气流速:0 · 413MPa;离 子源温度:550°C;
[0066] MRM检测参数见表2。
[0067] 表2:实施例1的MRM检测参数
[0ORft1
[0069] *为定量离子对。
[0070] 定性鉴定:对于氨基糖苷类药物的母离子和子离子对，在相同的条件下，如果试样 中的离子色谱峰与空白基质标准工作溶液中保留时间一致(变化范围在±2.5%之内）；样 品中目标物的两个子离子的相对丰度与浓度相当基质相同的标准溶液中相对丰度偏差满 足欧盟657指令有关要求(见表3)时，则判断该样品中存在该氨基糖苷类药物;若上述两个 条件不能同时满足，则判断不含该氨基糖苷类抗生素。
[0071 ]表3定性离子相对丰度的最大允许偏差
[007?!
[0073] 以基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线 如表4。
[0074] 表4鱼肉基质中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素标准工作曲线 rnn7R"l LUU/dj 力μ你凹Η 乂半不W里发?土：
[0077] 选取鱼肉、虾、鸡肉空白样品中，分别添加0.05、0.10、0.50mg/kg浓度水平的链霉 素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素标准溶液，按上述处理步骤进行残留量测 定，将测定浓度与氨基糖苷类药物理论添加浓度进行比较，得到添加回收率，每个添加水平 平行测定6次，得其相对标准偏差。五种化合物的平均回收率63.5%~76.4%，相对标准偏 差(RSD)为 7.9%~13.5%。
[0078] 本发明以大于3倍信噪比（S/N)对应的样品中目标物浓度作为检出限（L0D)，以大 于10倍信噪比（S/N)对应的样品中目标物浓度作为定量限(L0Q)，链霉素、双氢链霉素、卡那 霉素、壮观霉素、庆大霉素的检出限均为2〇yg/kg。链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉 素、庆大霉素的定量限均为50yg/kg。
[0079] 以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行 限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出 的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种同时测定食品中5种氨基糖巧类药物残留量的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 提取 称取打碎后的样品至离屯、管中，加入提取液，均质、混匀、离屯、，上清液转移至另一新的 离屯、管中，在提取液中加入正已烧，蜗旋振荡混匀，离屯、，弃去上层液体，取下层提取液过柱 净化； (2) 净化 提取液加胆液器中通过预处理过的SI^柱，待液体完全流出后，用水淋洗SI^柱，弃去所 有流出液，正压吹干，最后用甲醇洗脱，收集洗脱液至氮吹管，50°C水浴氮气吹干，用1.0ml 初始流动相蜗旋溶解，过0.22WI1滤膜至进样小瓶，供高效液相色谱一串联质谱仪测定； (3) 配制基质标准工作溶液 将空白样品按上述步骤（1)、（2)处理，用该空白样品基质溶液在50~1000yg/L范围内， 配制至少五个浓度的氨基糖巧系列基质标准工作溶液； (4) 液相色谱-串联质谱法化C-MS/MS)测定 质谱检测使用多反应监测扫描模式，链霉素的母离子582.4,子离子分别为263.3和 407.4，双氨链霉素的母离子584.3，子离子分别为263.3和409.3，卡那霉素的母离子485.3， 子离子分别为163.2和324.2;壮观霉素的母离子333.3,子离子分别为140.2和189.2;庆大 霉素的母离子478.4，子离子分别为205.2和160.2; a) 定量测定:将步骤(3)中系列基质标准工作液进行LC-MS/MS测定，W基质标准工作液 的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线;在相同条件下将步骤(2)中 样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中氨基糖巧类化合物的色谱峰面积，代入标准 曲线，得到样品液中氨基糖巧类药物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样 品中氨基糖巧类药物残留量； b) 定性测定:检测步骤(2)中样品液中目标化合物母离子和子离子对，若其离子色谱峰 保留时间与标准工作溶液一致;且样品液中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相 当基质标准溶液的相对丰度偏差满足欧盟657指令的要求时，则判断该样品中存在该种目 标化合物;若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种目标化合物； 所述的5种氨基糖巧类药物是链霉素、双氨链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素。2. 如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤（1)和（2)中提取液为憐酸盐缓冲 液，抑=2.0，含50mM庚烧横酸钢、25mM憐酸Ξ钢，用憐酸调PH值至2.0。3. 如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤（2)中SPE柱为BAKERBONDspe 0c1:aecyl C18。4. 如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤(2)中样品通过SI^柱时流速为< 3mL/min。5. 如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤(2)中SPE柱用5mL甲醇、5ml水预处 理。6. 如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤(2)甲醇洗脱体积为5mL。7. 如权利要求1所述的测定方法，其特征是步骤(4)中液相色谱的流动相的设置为 A:乙腊，B:含lOmM甲酸锭的体积分数是1 %的甲酸水溶液，流速0.5mL/min，进样量10μ L； 其中步骤(4)中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱的程序为:_A和8的％是体积比例。8. 如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤（4)中液相色谱的色谱柱为 Obelise R，柱溫为30°C。9. 如权利要求1所述的测定方法，其特征是步骤(4)中质谱检测使用电喷雾质谱检测， 离子源：电喷雾离子源；扫描方式:正离子扫描;检测方式：多重反应监测(MRM);电喷雾电 压:5500V;雾化气压力：0.344MPa;气帘气压力：0.172MPa;辅助气流速:0.413MPa;离子源溫 度：550°C。10. 如权利要求1所述的测定方法，其特征是步骤（1)和(2)中的满旋振荡时间Imin;上 述步骤(1)~(4)中样品接触到的容器为塑料材质。
【专利摘要】本发明公开了一种同时检测食品中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、新霉素残留量的测定方法，包括如下步骤：（1）提取；（2）净化；（3）配制基质标准工作溶液；（4）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定。本发明具有操作简便、准确、灵敏度高及重复性好的优点。完全能满足我国和欧盟、美国、日本对相应产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。
【IPC分类】G01N30/60, G01N30/02
【公开号】CN105548412
【申请号】CN201610128130
【发明人】王凤美, 邱芳, 张鸿伟
【申请人】山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年3月7日