一种同时测定食品中5种氨基糖苷类药物残留量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可同时检测多种氨基糖苷类抗生素残留量的测定技术方法，具体 地说是链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素5种氨基糖苷类药物残留量测定 方法，属于色谱检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 氨基糖苷类抗生素 (aminoglycoside antibiotics，AGs)是由氨基糖与氨基环醇 形成的苷。自1944年Waksman等发现链霉菌产生链霉素以来，氨基糖苷类抗生素的研究与开 发已经过了半个多世纪。由于该类药物具有性质稳定、抗菌谱广、杀菌力强、水溶性好，排泄 迅速完全，对许多致病菌有抗生素后效应，目前在临床上仍然是重要的抗感染药，广泛用于 各种革兰阴性菌感染和结核病的治疗。但是，由于AGs药物具有耳毒性和肾毒性等毒副作 用，且极易产生耐药性，欧盟明确规定禁止将AGs药物作为畜禽促生长添加剂使用；美国及 我国对动物源性食品中该类药物的残留监控都极为关注。
[0003] 目前，AGs的检测方法主要有酶联免疫法、液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色 谱-串联质谱法。酶联免疫法作为AGs的筛查方法，有着快速、高效、高通量等仪器方法不可 比拟的优势。AGs抗生素结构中不含共辄双键，缺少发色基团，但结构中含有较多的活性或 极性基团可供设计衍生化检测方法或分离方法。采用液相色谱法检测AGs，一般需要柱前或 柱后衍生化，荧光检测器检测。另外，由于该类化合物易溶于水，极性强，在C18柱上保留很 弱，通常需要在流动相中加入改性剂，增加目标物在柱子上的保留。目前，使用最多的是通 过加入离子对试剂来增强保留。绝大多数的液相色谱-串联质谱检测AGs的方法中，也都采 用离子对试剂增加化合物的保留和响应。但离子对试剂在质谱检测中有离子抑制作用，一 旦使用了离子对试剂，很难冲洗干净，严重干扰仪器对其他化合物的检测。
[0004] 在以上AGs的几种检测方法中，酶联免疫法由于简单快速的优势，作为定性筛查方 法应用较为普遍;液相色谱法和气相色谱-质谱法前处理都需要衍生化，操作复杂，灵敏度 也很难达到要求，应用越来越少;液相色谱-串联质谱法相对而言，灵敏度更高，选择性更 强，而且不需要衍生化，但由于离子对试剂的加入，对其他化合物的干扰问题嗜待解决。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种可以同时测定食品中链霉素、双氢链霉 素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素5种氨基糖苷类药物残留量的测定方法，以弥补现有技术 的不足。
[0006] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种仪器分析方法，以解决现有方法中 由于离子对试剂的加入，对其他化合物检测的干扰问题。
[0007] 本发明的测定首先是对样品的前处理的补充和改进。目前的文献报道及相关检测 标准中，氨基糖苷类抗生素的提取基本都采用磷酸溶液或磷酸盐缓冲液提取，三氯乙酸除 蛋白，采用离子交换型固相萃取小柱净化。但是由于离子交换型固相萃取小柱较难平衡，操 作有一定难度，容易造成方法重现性差、检测结果准确度不高的问题。本发明采用在磷酸盐 缓冲提取液中加入离子对试剂的方法，使得氨基糖苷类化合物与离子对试剂辄合，极性降 低，然后直接采用C18柱净化，大大降低了前处理的操作难度，提高了方法的重现性和准确 性。
[0008] 本发明的测定通过采用一种集传统反相色谱柱的作用和离子交换功能于一体的 混合色谱柱，使得色谱体系采用与质谱兼容更好的流动相体系，而不需要采用离子对试剂， 就可以很好的分离氨基糖苷类药物，而且峰形良好、灵敏度良好。
[0009] 本发明的测定方法包括如下步骤：
[0010] ⑴提取
[0011]称取打碎后的样品至离心管中，加入提取液，均质、混匀、离心，上清液转移至另一 新的离心管中，在提取液中加入正已烷，蜗旋振荡混匀，离心，弃去上层液体，取下层提取液 过柱净化。
[0012] ⑵净化
[0013] 提取液加贮液器中通过预处理过的SPE柱，待液体完全流出后，用水淋洗小柱，弃 去所有流出液，正压吹干，最后用甲醇洗脱，收集洗脱液至氮吹管，50°C水浴氮气吹干， 1. 〇ml流动相蜗旋溶解，过0.22μπι滤膜至进样小瓶，供高效液相色谱一串联质谱仪测定。
[0014] (3)配制基质标准工作溶液
[0015]将空白样品按上述步骤（1)、（2)处理，用该空白样品基质溶液在50~lOOOyg/L范 围内，配制至少五个浓度的氨基糖苷系列基质标准工作溶液；
[0016 ] (4)液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定
[0017] 质谱检测使用多反应监测扫描模式，链霉素的母离子582.4,子离子分别为263.3 和407.4，双氢链霉素的母离子584.3，子离子分别为263.3和409.3，卡那霉素的母离子 485.3，子离子分别为163.2和324.2 ;壮观霉素的母离子333.3，子离子分别为140.2和 189.2;庆大霉素的母离子478.4，子离子分别为205.2和160.2。
[0018] a)定量测定:将步骤(3)中系列基质标准工作液进行LC-MS/MS测定，以基质标准工 作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线;在相同条件下将步骤 (2)中样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中氨基糖苷类化合物的色谱峰面积，代入 标准曲线，得到样品液中氨基糖苷类药物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得 到样品中氨基糖苷类药物残留量；
[0019] b)定性测定:检测步骤(2)中样品液中目标化合物母离子和子离子对，若其离子色 谱峰保留时间与标准工作溶液一致;且样品液中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓 度相当基质标准溶液的相对丰度偏差满足欧盟657指令的要求时，则判断该样品中存在该 种目标化合物;若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种目标化合物。
[0020] 上述步骤(1)中提取液为10mL磷酸盐缓冲液(PH= 2.0，含50mM庚烷磺酸钠、25mM磷 酸三钠，用磷酸调PH值至2.0)。
[0021 ] 上述步骤（1)中正己烷体积为10mL。
[0022] 上述步骤(2)中固相萃取小柱为C18。
[0023] 上述步骤(2)中样品通过SPE时流速要< 3ml/min。
[0024] 上述步骤(2)中SPE小柱用5ml甲醇、5ml水预处理。
[0025] 上述步骤(2)甲醇洗脱体积为5mL。
[0026] 上述步骤(4)中液相色谱的流动相为A:乙腈，流动相B:1 %甲酸水溶液(含10mM甲 酸铵），流速〇.5mL/min，进样量10yL。
[0027] 上述步骤(4)中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱的程序为： Γηηοο?
[0030] 上述步骤(4)中液相色谱的色谱柱为Obelise R，该色谱柱具有传统反相色谱柱功 能及离子交换功能。柱温为30°C。
[0031] 上述步骤(4)中质谱检测使用电喷雾质谱检测，离子源：电喷雾离子源;扫描方式： 正离子扫描;检测方式：多重反应监测(MRM);电喷雾电压:5500V;雾化气压力:0.344MPa;气 帘气压力:0.172MPa;辅助气流速:0.413MPa;离子源温度:550°C。
[0032] 上述步骤(1)和(2)中的涡旋振荡时间lmin。
[0033] 上述步骤(1)~(4)中样品接触到的包括离心管在内的容器均应为塑料材质制成。
[0034] 本发明的有益效果在于：
[0035] 本发明采用具有传统反相柱和离子吸附两种作用的色谱柱，建立了一种不需要在 流动相中加入离子对试剂的液相色谱-串联质谱方法，有效解决了离子对试剂在质谱检测 中对其他化合物的影响，同时通过优化前处理方法，解决了AGs化合物由于极性大、易吸附 造成的回收率低的难题。
[0036]本发明能有效降低食品中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素残 留检测中的基质干扰，采用优化的前处理方法和色谱条件，结合串联质谱检测器应用于食 品中链霉素、双氣链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素定性确证和定量检测，平均回收率 63.5%~76.4%，相对标准偏差(1?0)为7.9%~13.5%，定量限为5(^8/1^。
[0037] 本发明具有操作简便、准确、灵敏度高及重复性好的优点。完全能满足我国和欧 盟、美国、日本对相应产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸 易健康发展提供有力的技术支撑。
【附图说明】
[0038] 图1为以鱼为基质，浓度为50.0ng/mL的链霉素多反应监测色谱图。
[0039] 图2为以鱼为基质，浓度为50.0ng/mL的双氢链霉素多反应监测色谱图。
[0040]图3为以鱼为基质，浓度为50.0ng/mL的卡那霉素多反应监测色谱图。
[0041 ]图4为以鱼为基质，浓度为50.0ng/mL的壮观霉素多反应监测色谱图。
[0042]图5为以鱼为基质，浓度为50.Ong/mL的庆大霉素多反应监测色谱图。
【具体实施方式】
[0043]现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。
[0044]实施例中使用的仪器与试剂如下：
[0045] CR21GIII型高速冷冻离心机(Hitachi，Japan) ;MS3型旋涡混合器（IKA，Germany); 1290快速高效液相色谱(Agilent，USA)-5500三重四极杆质谱仪(AB Sciense，USA);C18固 相萃取柱(J.T.Baker，USA)。
[0046] 试剂：甲醇、乙腈(HPLC级，Merke，Germany);甲酸铵（HPLC级，CNW，Germany);庚烧 磺酸钠、磷酸、磷酸三钠(分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司）。
[0047] 标准物质:链霉素，纯度大于96% ;双氢链霉素，纯度大于99 % ;卡