一种应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及环境污染检测和评价技术领域，尤其涉及一种应用淡水发光细菌检测 稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法。
【背景技术】
[0002] 目前在环境监测领域中，污染物的种类和浓度一般采用各种仪器与化学分析手段 可以比较快速而灵敏地分析测定出来，但大部分测定项目或参数还需定期采样。因而只能 反映采样瞬时的污染物浓度，不能反映环境已经发生的变化。而生物监测是20世纪初在一 些国家开展起来，近些年在水污染的生物监测成为活跃的研究领域。生物监测是从生物学 角度出发对环境质量的检测和评价依据，其可以通过生物个体、种群或群落对环境污染或 变化所产生的响应及时反映污染物的综合毒性效应及可能对环境产生的潜在危害。在实际 环境中，环境污染通常不仅是由单一污染物引起，而是由多种污染物同事存在形成的复合 污染。生物监测则可以更真实、更直接地反映出多种污染物在自然条件下对生物的综合影 响，从而更客观、更全面地评价各种环境状况。此外，生物监测能连续监测污染史，成本低廉 简单易行，可以灵敏简便地反映长期的污染效果。目前生物监测主要应用于地表水体，饮用 水，河流、湖泊沉积物，大气，土壤等的检测，鲜见针对稀土尾矿库周边地下水的污染检测及 相关研究。稀土尾矿库周边地下水属于静态水，循环更新周期长，水质参数变化慢，一旦污 染很难恢复，取出后水质状况容易发生改变，长期储存会使水质真实性受到影响。由于地下 水地质作用可以冲刷、溶蚀和搬运沉积物或岩石，破坏颗粒间的结合力，侵蚀岩石，并将侵 蚀产物搬运，所以与土壤，地表水等相比，该区域地下水含有更多的金属、氯、硫酸根和碳酸 氢根等离子。同时在稀土尾矿库周边地下水，往往还会由于尾矿库污染物泄露、污染物地表 径流、降水等原因而遭到不同程度污染，特别是一些放射性稀土元素可能进入地下水系统， 使环境情况相比地表水尤为复杂，这方面的生物监测工作研究起步较晚，所以我国目前监 测领域针对该区域地下水开展的生物监测工作十分有限。
[0003] 目前现有的国标水质急性毒性的测定发光细菌法仅适用于工业废水、耐污水体及 实验室条件下可溶性化学物质的水质急性毒性监测，应用于稀土尾矿库区地下水污染监测 还有一定的局限性和较大的不确定性。国标方法中采用明亮发光杆菌发光强度来响应环境 污染程度，明亮发光杆菌是一种海洋发光细菌，高度适应海洋生态环境，只有在盐度3 %，及 丰富的钠离子存在时才能良好生长和发光。所以检测土壤、湖泊河流或地下水等时必须要 满足他们对盐度和钠离子存在的需求，所得结果才比较可靠。然而，过多的钠离子或氯离子 均可能影响某些物质生物学毒性的表现。并且国标测定方法选用HgCl 2作为参比毒物，毒性 较强，使用后排入环境对生态环境和人体健康危害较严重。此外，国标法或者已报道的其他 参考方法在测定水体毒性时未考虑水质浊度的影响，会造成结果的偏差，导致准确度降低。 因此，需要开发一种简单快速检测稀土尾矿库周边地下水污染状况的急性毒性测试方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种采用淡水发光细菌青海弧菌针对稀土尾矿库周边污 染的地下水污染急性毒性测试的方法，克服以往生物监测方法的缺陷与不足，减少传统方 法各种因素带来的可能影响，使检测结果更可靠。
[0005] 为实现上述目的，应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的 方法，其特征在于，所述淡水发光菌为青海弧菌Q67。
[0006] 进一步，步骤为，
[0007] 将待检样品处理并稀释、调pH值；
[0008] 将活化后的青海弧菌Q67菌液加入到待检样品中进行反应；同时用所述稀释所用 的稀释液代替待检样品作为对照；
[0009] 设定标准参比毒物ZnS〇4,用所述稀释液稀释成不同浓度的ZnS〇4溶液，测定相应的 发光强度;采用origin 9.0软件对ZnS〇4浓度与发光强度进行非线性拟合，建立剂量-效应 曲线拟合方程；
[0010] 采用生物发光测定仪检测待检样品和对照的发光强度RLU;
[0011]计算相对抑制率，并将相对抑制率代入剂量-效应曲线拟合方程，求出与样品急性 毒性相当的对应的ZnS04的浓度，判定毒性效应。
[0012]进一步，所述待检样品的处理为将样品进行过滤或沉淀，使其池度小于300NTU。 [0013] 进一步，所述稀释是指用0.85wt%NaCl溶液来稀释，使检测的发光强度RLU为200-600万即可。具体的，本发明的稀释是用0.85wt%NaCl来稀释，稀释的合适程度通过检测发 光强度(200-600万）来调整控制。发光强度的检测是将100ul合适稀释的待检样品与900ul 的0.85wt%NaCl溶液混合，生成lOOOul的反应体系在发光仪中检测，读取发光强度。
[0014]进一步，所述调pH值为用盐酸或者氢氧化钠调pH值在6-9范围内。
[0015] 进一步，所述反应为常温反应15-30min;优选的，常温反应20min。
[0016] 进一步，所述标准参比毒物ZnS04是用于建立剂量-效应曲线拟合方程；用稀释液 将ZnS04稀释成不同浓度的溶液，检测相应的发光强度，建立并检验参比毒物稀释浓度与其 相对抑制率的剂量-效应拟合曲线。
[0017] 进一步，所述相对抑制率计算所采用的公式为，
[0018] 相对抑制率(R，％ ) = (1 -样品的RLU/对照的RLU) X 100;
[0019]所述根据结果判定毒性效应为：
[0020] 检测样品对应ZnS〇4的浓度C<1.0mg/L时，判定为无毒；
[0021 ] 对应ZnSCU的浓度1.0mg/L < C<1.6mg/L时，判定为轻微毒性；
[0022] 对应ZnS〇4的浓度1.6mg/L < C<2.7mg/L时，判定为中等毒性；
[0023] 对应ZnS〇4的浓度2.7mg/L < C<5.2mg/L时，判定为强毒性；
[0024] 对应ZnS〇4的浓度C2 5.2mg/L时，判定为超强毒性。
[0025]本发明通过对淡水发光菌检测条件优化，以及对稀土金属冶选尾矿库周边地下水 的毒性综合响应加以实际验证，形成了快速、灵敏准确的检测稀土尾矿库周边地下水污染 的测试体系，便于推广应用。同时采用淡水发光菌青海弧菌作为测试菌种，避免了海洋发光 菌所需盐度对发光的影响。测试快速方便，反应时间仅需20min，对样品pH值的要求比较广， 在6-9之间即可，样品浊度低于300NTU不需进行过滤处理，样品稀释液选用0.85%NaCl溶 液，配制简便省时，参比毒物为ZnS〇4，减少了对生态环境和人体健康的影响。
[0026] 本发明广泛适用于尾矿库周边地下水污染的检测。
[0027] 本发明淡水发光细菌测试条件优化为:最佳反应时间为20min;测试用pH值控制在 6-9之间；稀释液选择0.85%NaCl;样品浊度控制在300NTU以下，不需要进行过滤处理;标准 参比毒物为ZnS〇4。
【附图说明】
[0028] 图1是不同反应时间对测试发光强度的影响图。
[0029] 图2是不同pH值对样品测试相对抑制率的影响图。
[0030] 图3是发光细菌对不同pH值的GW-7样品的相对抑制率的响应图。
[0031 ]图4是不同稀释液对发光强度的影响图。
[0032]图5是样品不同浊度对青海弧菌相对抑制率的影响图。
[0033]图6为函数拟合不同浓度的ZnS〇4(l)对发光菌相对抑制率的剂量-效应曲线图。 [0034]图7为函数拟合不同浓度的MnCl2(2)对发光菌相对抑制率的剂量-效应曲线图。 [0035]图8为函数拟合不同浓度的AgN0 3(3)对发光菌相对抑制率的剂量-效应曲线图。 [0036]图9为原位稀土尾矿库17个地下水样品对青海孤菌相对抑制率的影响图。
【具体实施方式】
[0037]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例 中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明 书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0038] 菌种活化:将装有青海弧菌067(￥11^1〇.011111 &以1^&067)冻干粉(购于北京滨松 光子学商贸（中国）有限公司）的安瓿瓶先置于室温内约l〇_15min，在超净工作台中切开安 瓿瓶，取已灭菌的〇.85wt%NaCl溶液100yL点在培养皿平板上，用接种环取一环菌种蘸取点 的溶液在平板上划线，倒置放于恒温培养箱中于22°C培养24h。
[0039] 新鲜菌液制备：挑取单个菌落接种于斜面培养基上，于22°C培养24h后转接于斜 面，活化为第3代菌种;将培养好的第3代菌种接种到15mL液体培养基中22°C振荡培养16-18h(处于对数期），待用。
[0040] 待测样品：以不同浓度的Na2S04溶液作为受硫酸盐污染的地下水样品。
[0041 ]液体培养基:淡水发光细菌Q67培养基成分见表1。
[0042] 表1.发光细菌Q67培养基配方表
[0044] 检测发光细菌发光强度:打开生物发光测定仪(BERTHOD LB9501发光仪，德国），预 热15min，调零，备用。取适量体积的已灭菌0.85wt %NaCl溶液，调整菌液浓度，测其发光强 度(RLU为200-600万）。实验前用0.85wt%NaCl溶液稀释待测样品和ZnS〇4,设置不同的稀释 度，分别取〇. 9mL加入化学/生物发光仪的低背景管中，每个稀释度做3个平行，以0.85wt % NaCl溶液为对照，为减少仪器测定延长反应时间所引起的误差，每隔20s向同一平行管的另 外管中加〇. lmL菌悬液到样品管中，混勾后控制待测反应时间在20min。
[0045] 按各管原来加菌液的顺序，当某管达到记录的反应时间，立即将测试管放入仪器 测试舱，读出并记录其发光强度。
[0046] 计算测试样品急性毒性:根据试验测得的发光强度RLU(Relative Light Units)， 计算样品的相对发光抑制率:相对抑制率(R，％) = (1-试样的RLU/对照的RLU) X 100。
[0047] 建立标准参比毒物ZnS〇4的剂量-效应曲线，origin 9.0软件拟合ZnS〇4浓度与发光 强度的关系方程：
[0048] y = 3.32+101.1/(l+l(T((5.3-x)*1.25))。见图 6。
[0049] 实施例1:反应时间和pH值的选择试验
[0050] 该试验对测试方法中的测试反应时间以及样品pH值适用范围进行优化。
[0051 ] 分别配制并稀释不同浓度的Na2S〇4溶液(500、1000和10000mg/L)，在该溶液基础上 进行反应时间以及pH值的优化实验。
[0052] 反应时间优化：分别设置不同的反应时间0、3、7、10、15、20、30、40、60、80、100和 120min〇
[0053] pH值