蛋白A单克隆抗体包被液和兔IgG包被液以Ιμ?/cm的线速包被在硝酸纤维素膜4上对应的检测线5和控制线6上，检测线5和控制线6间隔6mm，在湿度〈30 %条件下37 V烘干24h后，制成荧光免疫层析试纸板。
[0064]用切条机将制备好的荧光免疫层析试纸板纵向切成4mm宽的荧光免疫层析试纸条，将其放入卡壳内经压壳机处理得到免疫层析检测卡。
[0065]第三步:样品稀释液的配制
[0066]取0.02M pH7.0的PBS缓冲液IL，加入8ml吐温20，5.1g牛血清白蛋白和0.19g叠氮钠，超声直至固体全部溶解混合均匀。
[0067]第四步:样本检测
[0068]I)线性、检测限和精密度评估:
[0069]采用阴性牛血清作为稀释液，将血清淀粉样蛋白A标准品配制成浓度为200、180、160、140、120、100、80、60、40、20和Omg/Ll的标准品溶液，取标准品I ΟΟμΙ加入I ΟΟμΙ样品稀释液，吹打15次后取100μ1加入到加样孔8中，15分钟后采用荧光检测器检测。结果表明，线性的相关系数r~2大于0.99，检测限为0.5mg/L，各浓度的检测变异系数均小于8%。
[0070]2)线性参数的验证:
[0071]采用低值人血清和高值人血清，配制浓度为200、100、120、80和40mg/L的血清淀粉样蛋白A人血清溶液，每个样本重复4次，结果表明，r~2大于0.99，最高检测范围可达到200mg/Lo
[0072]3)准确度的评估:
[0073]采用血清淀粉样蛋白A浓度为2mg/L的人血清样本作为基础样本，加入同体积不同浓度的血清淀粉样蛋白A标准物人血清，配制成浓度为140、80、14和3mg/L的血清淀粉样蛋白A人血清溶液。另一份样本加入相同体积的阴性人血清，对回收样本和基础样本进行4次重复检测分析，并进行计算。结果表明，回收率在95%?105%范围内。
[0074]以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护。
【主权项】
1.一种血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤I)探针固定垫制备:将血清淀粉样蛋白A单克隆抗体按比例与活化白蛋白荧光胶乳微粒偶联反应制得血清淀粉样蛋白A单克隆抗体荧光胶乳微粒，再将所述血清淀粉样蛋白A单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗兔IgG荧光胶乳微粒按一定比例混合得到混合荧光胶乳微粒，所述混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释后喷在玻璃纤维上制得探针固定垫； 步骤2)免疫层析试纸条制备:将样品垫、探针固定垫、层析膜、吸水纸依次贴在PVC衬板上，将所述血清淀粉样蛋白A单克隆抗体包被在层析膜的检测线上，将羊抗兔IgG包被在层析膜控制线上，进而制得免疫层析试纸条； 步骤3)样品稀释液制备:将包括有牛血清白蛋白、表面活性剂、分散剂和防腐剂的混合物与缓冲液混合均匀制得样品稀释液； 步骤4)样品检验:取血清、血浆或全血样品混合至所述样品稀释液，加入免疫层析试纸条进行免疫层析反应，层析反应结束后经荧光检测器荧光检测。2.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测方法，其特征在于:步骤I)中，所述活化白蛋白荧光胶乳微粒的制备是先将荧光胶乳微粒与活化剂反应制得活化荧光胶乳微粒，再与白蛋白按比例偶联反应得白蛋白荧光胶乳微粒，所述白蛋白与活化荧光胶乳微粒的比例为0.05:100?0.2:100，所述白蛋白荧光胶乳微粒进一步与活化剂反应制得所述活化白蛋白荧光胶乳微粒，其中，所述白蛋白的种属包括人、牛、羊或鼠。3.根据权利要求2所述的血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测方法，其特征在于:步骤I)中，所述羊抗兔IgG荧光胶乳微粒的制备是将羊抗兔IgG按比例与活化荧光胶乳微粒偶联反应制得，所述羊抗兔IgG与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100?0.2:100。4.根据权利要求2所述的血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测方法，其特征在于:步骤I)中，所述活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，二者重量比为1:6?1:1，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与荧光胶乳微粒的重量比为I: 100?5:100。5.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测方法，其特征在于:步骤I)中，所述血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与活化白蛋白荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100?0.2:100,所述羊抗兔IgG与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100?0.2:100，所述血清淀粉样蛋白A单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒相混合的比例2:1?6:1 ο6.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测方法，其特征在于:步骤I)中，将混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释2?6倍，以2?6ul/cm的速度均匀喷在宽度为0.7?1.3cm的玻璃纤维上，在30?55°C下干燥2?24h后制得探针固定垫。7.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测方法，其特征在于:所述荧光探针微球稀释液为含有蔗糖、牛血清白蛋白和表面活性剂的缓冲液，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tr i s缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20或吐温80。8.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测方法，其特征在于:步骤3)中，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-1OO或聚乙二醇，所述防腐剂为叠氮钠或proclin，所述分散剂为聚乙烯吡咯烷酮10K、聚乙烯吡咯烷酮40K或聚乙烯醇。9.一种血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测试剂盒，包括试剂盒体以及稀释液瓶，所述试剂盒体包括免疫层析检测卡，所述免疫层析检测卡包括PVC衬板以及固定在PVC衬板上的样品垫、探针固定垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其特征在于: 所述样品垫搭接在探针固定垫上，所述探针固定垫和吸水纸分别搭接在所述硝酸纤维素膜两侧，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和控制线，所述检测线内包被有血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，所述控制线内包被有羊抗兔IgG ；所述探针固定垫由血清淀粉样蛋白A单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒组成的混合荧光胶乳微粒干燥制得。10.根据权利要求9所述的血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于:所述免疫层析检测卡还包括壳体，所述壳体上设置有加样孔、检测窗口、编码区域和把手，所述加样孔位于所述样品垫处，所述检测窗口位于所述检测线和控制线处，所述编码区域位于检测窗口和把手之间，所述把手位于所述壳体上位于靠近吸水纸的一侧。
【专利摘要】本发明涉及血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测方法及其检测试剂盒。该方法步骤为探针固定垫制备、免疫层析试纸条制备、样品稀释液制备和样品检验，其中，将血清淀粉样蛋白A单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗兔IgG荧光胶乳微粒混合后经金稀释液稀释喷在玻璃纤维上制得探针固定垫，并将血清淀粉样蛋白A单克隆抗体包被在检测线上，将羊抗兔IgG包被在控制线上进而制得免疫层析试纸条。本发明检测试剂盒包括免疫层析检测卡，其包括PVC衬板、样品垫、探针固定垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，该探针固定垫由血清淀粉样蛋白A单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒混合干燥制得。因此，本发明具有检测灵敏度高、准确度高、操作简单、成本低的优点。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105675879
【申请号】CN201511020151
【发明人】张华 , 廖平璋, 张鹏, 张金林
【申请人】苏州市博纳泰科生物技术有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2015年12月31日