专利名称：桂竹香外源基因转移到桑树体内的制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程桑树植株外源基因的转移领域，更具体涉及一种桂竹香外源基因转移到桑树体内的制备方法。
桑叶是茧丝绸的物质基础。不断提高桑叶产量和质量，才能生产出优质的蚕茧、生丝和丝织产品，在竞争激烈的国际市场中立于不败之地。桑叶的蛋白含量是决定茧丝绸产品的质量的关键因素，普通桑树品种的蛋白含量还不能完全满足生产优质茧丝绸的需要，普通桑树抗虫性较差，桑叶产量较低，产量品质不高，饲养成绩不佳，经济效益低下。品种选育一直是提高桑叶产量、改良桑叶品质、带动生产进步的重要措施，但传统育种方法所需时间较长，过程繁琐，需耗费大量的人力和物力，而且通过杂交等方法获得的优良品种多容易受到亲本材料的限制。经检索未发现一种桂竹香外源基因转移到桑树体内的技术被公开。
本发明的目的是提供了一种桂竹香外源基因转移到桑树体内的制备方法，方法易行，操作简便。成功地解决了桑树工程植株将比常规品种在光合作用强度、桑叶蛋白质含量、营养物质的利用、转化和运输能力方面都大幅度提高的问题.并可增强桑树的抗虫性(但对家蚕无害)和抗逆性。
本发明是通过以下技术来实现的采用的桂竹香(Cheiranthus cheiri L.)是十字花科植物，其植株生长者大田中不易受蚜虫、鞘翅目昆虫为害，生长旺盛、光合作用极强。经研究发现，所克隆的细胞外膜蛋白基因(OEM1基因)在植物抗虫性、细胞物质运输、信号识别、传递、细胞代谢等方面起重要作用。植物的外膜蛋白，特别是叶绿体外膜蛋白是离子的传送器，传送Na+、k+这种传送器的基因在人、鼠、醇母中已得到，基因序列长约2.4kb，编码547个氨基酸，它与得到的OEM1基因有一定的同源性，因此OEM1基因与Na+、K+的传送有关。桂竹香外膜蛋白基因转移到桑树体内的步骤是1)构建双元载体系统采用双元载体系统，通过反式激活T-DNA转移。双元载体系统主要包括两个Ti质粒，即mini-Ti和Helper Ti(Helper Ti质粒主要作用是提供vir基因功能，激活处于反式位置上的T-DNA转移)，其中mini-Ti质粒含有来自pTiT37的T-DND左右边界序列，在两个边界序列之间的T-DNA区含有植物选择标记和启动子的Nos-Npt-II，以及来自噬菌体M13mp19的多种酶连接接头的Lacz基因。在Lacz基因内部含有多克隆位点。外源基因(OEM1基因)可以便利地插入其间使其本身失活，并且可在含X-gal和IPTG的平板上直接筛选，操作极为方便。将OEM1基因用适当的限制性内切酶消化后与mini-Ti质粒相连，并在X-gal和IPTG的平板上筛选白色菌落，经提取质粒，酶切检查后，确定OEM1基因已插入了mini-Ti质粒的多克隆位点区，将mini-Ti质粒纯化后转化含有Helper Ti质粒的根癌农杆菌感受细胞，这时含有mini-Ti质粒和Helper Ti质粒的根癌农杆菌可直接用于植物细胞的转化。
2)构建受体系统，选用桑树幼年期叶片作为受体，并在转化操作前，对幼叶进行抗生素敏感性测定，并根据野生型农杆菌在外植体组织中形成肿瘤的诱导率，发生时间及生长状态确定受体植物的敏感程度，从而选择浸染敏感的农杆菌种类。
3)目的基因(OEM1基因)的转化首先采用光密度测定法来确定农杆菌浓度，为了保证菌种(普通)的纯化，采用多个单菌落分别培养成几个菌群进行保留或应用。挑取单菌落接种在液体培养基内进行液体振荡培养12-24小时，离心(4000r/min)，倒掉上清液，加入植物外植体诱导愈伤组织的液体培养基，使其OD600值达到0.5。外植体在转化前预培养时间为2天。
预培养后的外植体切割成小块浸泡在菌液中，浸泡时间在5-8分钟内，用无激素植物培养基或无菌水漂洗，再用无菌吸水纸吸干，将其培养在诱导愈伤组织的固体培养基上，与农杆菌共培养，农杆菌转化时，并不“侵入”到植物细胞中，而是把T-DNA转移到植物细胞，在创伤部位生存16小时后菌株才诱发肿瘤，因此共培养时间长于10小时。但共培养时间太长，由于农杆菌的过度生长，植物细胞因受到毒害而死亡，因而采用GUS基因瞬时表达法测定共培养的最佳的时间，并根据获得的转化愈伤组织频率为最终依据，确定外植体共培养时间需4-6天。
4)外植体脱菌与农杆菌共培养的外植体表面及浅层组织中共生有大量农杆菌，必须把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培养基上进行脱菌培养，脱菌培养时间需5-6次继代培养，但为了杀死残留在维管束和细胞间隙中的农杆菌，一直使用抗生素直到试管苗形成。
5)选择培养在选择培养基中加入km抑制非转化细胞的生长，km浓度范围50-100mg/L。一般情况下试管苗对km选择压力不如愈伤组织那样敏感，因此非转化的试管苗也可能在选择培养基上生长，但根对抗生素的敏感性很强，因此在含高浓度的km选择压力的选择培养基上非转化苗是难生根的，只有转化苗才可能生根，所以苗的生根能力是实现转化的一个有力佐证。
转化苗的保持与繁殖直接关系到生产实践的应用，目前采用两条途径实现转化苗的保持与繁殖，一条是营养繁殖途径，它包括试管苗的无性快速繁殖及嫁接，扦插等田间的营养繁殖方式，从而保证充足的转化再生植株，第二条途径是种子繁殖，这对于转基因植株的正常表达、遗传特性及向生产应用过渡有重要作用。
6)外源基因(OEM1基因)整合的鉴定在完成基因转化后，外源基因是否进入植物细胞，进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上，整合的方式如何，整合到染色体上的外源基因是否表达，需进一步加以证实。第一步工作就是筛选转化细胞；第二步就是对转化植株进行分子生物学鉴定。①通过Southern杂交证明外源基因在植物染色体的整合，通过原位杂交可确定外源基因在染色体上整合的位点，Southern杂交是用标记的外源基因(OEM1基因)作探针，与植物细胞染色体DNA进行杂交，具体的检测方法有Southern斑点杂交及Southern印迹杂交两种，斑点杂交可以较快地大略检测一下植物基因组是否含有外源基因，利用Southern印迹不仅可以分析出外源基因是否整合到植物的染色体上，而且还可以对外源基因的整合情况进行分析，如整合的外源基因是单拷贝还是多拷贝，多拷贝的插入方式如何，是串联插入还是分散插入，串联的方式是同向还是反向等，由于使用农杆菌介导的转化体，其分析的基本方法是用重叠探针杂交，并以转化的外源基因不同拷贝数为对照。②通过Northern杂交可证明外源基因在植物细胞内是否正常转录，生成特异的mRNA。③通过Western杂交可证明外源基因在植物细胞内转录及翻译成功，生成特异蛋白质。第三步则是进行性状鉴定及外源基因表达调控，由于转OEM1基因是为了获得抗虫性和提高桑叶产量，因而可以根据对照，选择符合由OEM1基因编码的特异蛋白质影响代谢而产生的具有抗虫和高产等经济性状的桑树植株，从而达到OEM1基因转化的目的，最后是进行遗传学分析，并获得转基因植物品种，应用于生产。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果采用的双载体农杆菌转化的外源基因整合位点较稳定，常在T-DNA 25bp处与植物细胞整合，大多数是单位点整合，整合的外源DNA基本保持其结构的完整性，结构的变化很少，整合外源基因的拷贝数常以单或低拷贝T-DNA为主，也有少量多拷贝T-DNA以首尾串联形式在单位点整合，整合的外源基因在转基因植株的显性表达率较高，即多数外源基因能有效表达，共抑制现象相对较少，外源基因在转基因植株中的分离符合孟德尔遗传规律，大多数的F1转基因植株以3∶1分离。并且获得的桑树工程植株将比常规品种在光合作用强度、桑叶蛋白质含量、营养物质的利用、转化和运输能力方面都有大幅度的提高，并可增强桑树的抗虫性(但对家蚕无害)和抗逆性，降低了化学农药的使用量。
实施例将OEM1基因用适当的限制酶消化后与mini-Ti质粒相连，并在x-gal和IPTG的平板上筛选白色菌落，经提取质粒酶切后电泳检查，确定OEM基因已插入mini-Ti质粒的多克隆位点区。然后将mini-Ti质粒纯化后转化含有HelperTi质粒的根癌农杆菌感受细胞，将根密农杆菌在平板上培养、保存。
从田间或温室栽培的植株上获得桑树叶片，用蒸馏水冲洗数遍后，70％乙酶洗45秒，0.1％升汞消毒6-8分钟，无菌水冲洗5遍，无菌滤液吸干水分将无菌叶片剪成0.5×0.5cm的小块，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，预培养4-6天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。从平板上挑取单菌落，接种到20mi附加km抗生素的细菌培养液体培养茎中，可以27℃，180r/min培养至OD600为0.6-0.8，再取上述菌液按1％--2％的比例，转入无抗生素的细菌培养液体培养基中，可以27℃，180r/min条件培养6小时，OD600为0.2-0.5即可用于转化于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中，从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡1-5分钟，取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上，在28℃暗培养条件下共培养2-4天。
将经过共培养的外植体转移到加有选择压即100g/2的KM的脱菌愈伤组织诱导培养基上，在光照1000-2000Lx，25℃条件下进行选择培养。
选择培养2-3周后，外植体的转化细胞将化化出抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入附加选择压的生长或分化培养基中令其生长或诱导分化。
待不定芽长到1cm以上时，切下并插入含有选择压的生根培养基上进行生根培养，两周左右长出不定根。
按常规方法提取转基因桑树幼叶DNA(含量为0.5-1mg/ml)和非转化植物幼叶总DNA(含量为0.5-1mg/ml)(阴性对照)。取新的0.5ml离心管，高压灭菌，按序列加入下列试剂dH2O 7ml，10x buffer2ml，样品DNA 10ml，限制酶1ml，混匀，4000r/min离心3-5秒，37℃保温过夜。
配制0.8％的琼脂糖凝胶，将上述的溶液中加入5ml溴酚蓝，混匀，将全部样品分别点于两个点样孔中。并取中间载体质粒DNA溶液作阳性对照，点于第三个样品孔中。25V电泳16小时。紫外光下检测植物DNA样品酶解效果。将凝胶放入搪瓷方盘中切去一角(作样品序列标记)，加入变性液没过凝胶，在脱色摇床上变性1小时。用蒸馏水漂洗一次，换中和液中和1小时，其间更换一次中和液。将尼龙膜与凝胶印迹，于254nm紫外光下照射4分钟。并将膜于2xscc溶液中漂洗，晾干。
将尼龙膜在预杂交液中42℃预杂交2小时。将预杂交液倒去，加入加有地高辛标记探针的杂交液，42℃，100r/min杂交过夜。
洗膜二次，显色，可检测OEM1基因是否整合到桑树的基因组中。
为检测OEM1是否在桑树中表达，进行Norther杂交取转基因植物的总RNA和非转基因植物的总RNA(阴性对照)作甲醛变性电泳。将尼龙膜与凝胶印迹，并在254nm紫外光下照射4分钟。同实施例2中所述一样预杂交，杂交，洗膜，显色。根据杂交的结果可判断所转化的OEM1基因是否在桑树中表达。
权利要求
1.一种桂竹香外膜蛋白基因转移到桑树体内的制备方法，包括下列步骤A.构建双元载体系统；B.构建受体系统；C.目的基因的转化；D.外植体脱菌；E.选择培养；F.外源基因整合。
2.根据权利要求1所述的一种桂竹香外膜蛋白基因转移到桑树体内的制备方法，其特征在于构建双元载体系统，通过反式激活T-DNA转移，双元载体系统包括两个Ti质粒即mini-Ti和Helper-Ti。
3.根据权利要求2所述的一种桂竹香外膜蛋白基因转移到桑树体内的制备方法，其特征是mini-Ti质粒来自pTiT37的T_DNA边界序列，在两个边界序列之间的T_DNA区含有植物选择标记和启动子的Nos-Npt-II，以及来自噬菌体M13mp19的多种酶连接接头的Lacz基因。
4.根据权利要求1所述的一种桂竹香外膜蛋白基因转移到桑树体内的制备方法，其特征在于构建受体系统选用桑树幼期叶片，转化前，对幼叶进行测定，选择浸染的农杆菌。
5.根据权利要求1所述的一种桂竹香外膜蛋白基因转移到桑树体内的制备方法，其特征在于目的基因的转化采用光密度测定法来确定农杆菌浓度，挑取单菌落接种在液体培养基内进行液体振荡培养12-24小时，离心4000r/min后加入植物外植体诱导愈伤组织的液体培养基，外植体在转化前培养时间为2天；切割成小块浸泡在菌液中浸泡5-8分钟，再将其培养在诱导愈伤组织的固体培养基上，与农杆菌共培养4-6天；然后继代脱菌培养5-6次。
6.根据权利要求1所述的一种桂竹香外膜蛋白基因转移到桑树体内的制备方法，其特征在于外源基因整合的步骤是A.筛选转化细胞；B.转化植株；C.进行性状鉴定及外源基因表达调控；D.进行遗传学分析，并获得转基因植物品种；
7.根据权利要求6所述的一种桂竹香外膜蛋白基因转移到桑树体内的制备方法，其特征在于外源基因表达A.Southern杂交，Southern杂交是用标记的外源基因作探针，与植物细胞DNA进行杂交；B.通过Northern杂交证明外源基因在植物细胞内正常转录，生成mRNA；C.通过Western杂交证明外源基因在植物细胞内转录及翻译成功，生成蛋白质。
全文摘要
本发明公开了一种桂竹香细胞外膜蛋白外源基因(0EM1)转移到桑树体内的制备方法,包括下列步骤:首先是构建双元载体系统;其次是构建受体系统;再次是目的基因(0EM1基因)的转化;第四是外植体脱菌;第五是选择培养;第六是外源基因(0EM1基因)整合。本发明方法易行,操作简便。桑树工程植株将比常规品种在光合作用强度、桑叶蛋白质含量、营养物质的利用、转化和运输能力方面都大幅度提高。并可增强桑树的抗虫性(但对家蚕无害)和抗逆性。
文档编号A01H1/06GK1362519SQ0110640
公开日2002年8月7日 申请日期2001年1月2日 优先权日2001年1月2日
发明者李旭锋, 刘天艳, 王劲, 袁旭 申请人:成都天友发展有限公司