专利名称：一种生物杀虫剂的制备方法
技术领域：
本发明属于农业害虫的生物防治技术领域，特别是涉及到一种对农业害虫的高效、无毒、安全以及对环境无污染的微生物杀虫剂的制备方法。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)制剂是当前应用最广，最有效的微生物杀虫剂。属于革兰氏阳性菌，其毒效主要来源于芽孢形成期间产生的伴孢晶体，1938年在法国首次成为商品。自商品化以来，Bt产品就以其高效安全、对目标害虫的特异性而备受青睐，并逐渐成为研究最深入、应用最广泛的生物杀虫剂。尽管Bt有诸多优点，但它在田间应用时也存在杀虫效果不理想、对某些目标害虫不敏感等问题。解决这一问题的途径的问题有二一是大量分离鉴定更有效的Bt株系，如Bt杀虫变种(Bt subsp entomocidus)，但随着Bt研究的深入，通过筛选获得能够用于生产的高毒株越来越困难；二是大力发展各种增效剂和增效因子，提高现有高毒菌株的杀虫活性。如张循浩等(1996)用Bt与棉铃虫NPV加适量助剂复配，明显提高了Bt的杀虫效果；林开春等(1998)通过调查筛选得到了三株对Bt制剂有明显增效作用的细菌菌株34-16、30-3和C16。所有这些增效途径，要么需要对Bt制剂进行特殊的加工处理，要么需要在Bt制剂生产之后额外添加其他增效因子，既延长了生产时间，又提高了生产成本，增效效果也不令人十分满意。本发明避免了所有这些不利因素，且增效效果也达到了前所未有的高度。
发明内容
本发明目的在于提供一种生物杀虫剂的制备方法，采用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus，Bc)混合发酵，解决了苏云金芽孢杆菌Bt产品的增效问题，提高了苏云金芽孢杆菌Bt产品的杀虫效果。为达到上述目的，本发明采用以下技术措施 瓶发酵----培养至20％芽孢脱落—后处理—实验制剂---生物测定---增效菌筛选---拮抗菌的剔除---混合发酵(接种比例、接种时间的选择)---培养至15～20％芽孢脱落—后处理—实验制剂---生物测定毒效稳定性评价。
其步骤是，将苏云金芽孢杆菌(Bt)与蜡状芽孢杆菌(Bc)按如下方法进行混合发酵1、增效菌的筛选将对目标害虫高效的苏云金芽孢杆菌Bt和实验室收集保藏的蜡状芽孢杆菌Bc分别接种于发酵培养基进行发酵培养，将发酵培养液以1∶1-8∶1比例混合后进行生物测定，以该高效菌株为对照，筛选对苏云金芽孢杆菌Bt有增效作用的蜡状芽孢杆菌Bc菌株；发酵按如下方法进行1)苏云金芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌活化将苏云金芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌接种于LB斜面上，30℃培养至芽孢全部脱落。LB斜面配方为NaCl 1％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，琼脂1.5％，PH7.0。
2)苏云金芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌分别同步化从活化的LB斜面或平板上刮取一环菌，加入装有5ml蒸馏水的试管中摇匀，温度控制在72～76℃，水浴12～15分钟，取出冷却至常温；3)摇瓶发酵取上述同步化的菌悬液1ml接种于500ml大三角瓶中，其中装培养基30～40ml，摇瓶培养基配方如下淀粉2％，豆粉4％，酵母粉0.5％，蛋白胨0.5％，KH2PO40.1％，K2HPO40.2％，PH8.5。30℃，200rpm摇瓶培养，至15～20％芽孢脱落。
2、同活性苏云金芽孢杆菌Bt的拮抗的菌株的剔除在制备LB平板的过程中加入高效的苏云金芽孢杆菌Bt的芽孢，得到含苏云金芽孢杆菌芽孢的平板，然后将增效蜡状芽孢杆菌Bc菌株接种于其上，30℃培养，能够生长且长势良好的菌株即为能够与高效苏云金芽孢杆菌Bt菌株共培养的增效菌株。
平板制备方法为从实验室收集和分离菌株后保藏的LB斜面上刮取一环菌，加入装有5ml蒸馏水的试管中摇匀，温度控制在72～76℃，水浴12～15分钟，取出冷却至常温；配制LB培养基NaCl 1％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，琼脂1.5％，PH7.0，灭菌，冷却至50℃后，每100ml培养基加入5ml上述芽孢悬液，倒平板。
3、混合发酵条件1)接种比例将杀虫高效苏云金芽孢杆菌Bt菌株与上述增效蜡状芽孢杆菌Bc菌株按不同的芽孢数比例(1∶1-8∶1)接种于摇瓶培养基中，30℃，200rpm摇瓶培养，镜检观察生长情况，取30-60小时的培养物作生物测定，选取增效效果最佳的比例(1∶1-4∶1)
2)接种时间上述最佳接种比例获得后，改变两菌株的接种时间，既先接种高效苏云金芽孢杆菌Bt菌株于培养基中，摇瓶培养一段时间(0-8小时)后，再接种增效蜡状芽孢杆菌Bc菌株，培养到一定时间(40-52小时)后，取培养物作生物测定，选取增效效果最好的两菌株接种间隔的时间(0-6小时)；4、混合发酵通过确定的合适接种时间和接种比例即为混合发酵的两菌株的接种比例和时间。通过上述步骤得到能分别与苏云金杆菌DL5789(已保藏，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No.M202003)混合发酵的两株增效菌Ym-2102(蜡状芽孢杆菌，Bacillus cereus，Bc；已保藏，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No.M202011)和Bc-ATCC33018(蜡状芽孢杆菌，Bacillus cereus，Bc；标准菌株，本实验室收集保藏，可从标准菌株保藏处获得)。将活性苏云金芽孢杆菌Bt菌株和增效蜡状芽孢杆菌Bc菌株按照步骤1进行同步化，按步骤3接种时间和比例接种到摇瓶培养基中发酵培养，以芽孢脱落15～20％为发酵终点，得到的培养物即为混合发酵产物；5、制剂制备及稳定性将上述发酵产物进行防腐处理后，生物测定确定毒效。防腐处理方法为加入氯化钠3％，苯甲酸钠0.5％，调节PH至5.0~5.5。放置一段时间(三个月以上)后，重新进行生物测定，检查其毒效的稳定性。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果本发明设计了一套行之有效的技术路线，首次在国际上解决了通过混合发酵的途径来实现对苏云金芽孢杆菌的杀虫效果进行增效的目的，既节约了时间也成本低廉。具体说来，本发明有如下三大优点1、不增加生产成本，即无须向发酵培养基或者培养产物中添加额外的增效因子，只需要将生产菌株和增效菌株共培养，培养物即为增效后的产物；2、节约了生产时间，由于无须在发酵生产后对发酵产物进行额外的加工处理，大大缩短了产品的生产时间，缩短了生产周期；3、增效效果的放大通过此途径得到的增效效果，比分别对生产菌和增效菌进行单独发酵后的产物复配的增效效果要明显的多，有的甚至提高到2～3倍，这也是其他增效途径所无法比拟、无法实现的。
具体实施例方式
实施例1通过上述途径得到对Bt菌株DL5789增效的一株蜡状芽孢杆菌Ym-2102。以DL5789发酵液单独进行生物测定，以甜菜夜蛾初孵幼虫为供试虫，LC50为1.047ml/g饲料；将DL5789与Ym-2102分别进行发酵后，将发酵液按体积比以4∶1的比例混合后对甜菜夜蛾进行生物测定，其LC50为0.58ml/g饲料；增效效果为80.52％；而将DL5789与Ym-2102按芽孢数为3∶1的比例同时接种，培养物对甜菜夜蛾初孵幼虫的生物测定，其LC50为0.272ml/g饲料，增效效果为284.9％，比分别发酵后混合生测的增效效果提高了204.38％。
实施例2通过上述途径得到对Bt菌株DL5789增效的一株蜡状芽孢杆菌Bc-ATCC33018，以DL5789发酵液单独进行生物测定，以甜菜夜蛾初孵幼虫为供试虫，LC50为1.047ml/g饲料；将DL5789与Bc-ATCC33018分别进行发酵后，将发酵液按体积比以4∶1的比例混合后对甜菜夜蛾进行生物测定，其LC50为0.89ml/g饲料，增效效果为17.64％；而将DL5789与Bc-ACTT33018按芽孢数为2∶1的比例，在接种两份DL5789四小时后再接种一份Bc-ATCC33018，混合发酵后发酵液对甜菜夜蛾初孵幼虫的生物测定，其LC50为0.473ml/g饲料，增效效果为121.35％，比分别发酵后的发酵液进行混合后的生物测定的增效效果提高了103.71％。
权利要求
1.一种生物杀虫剂的制备方法，采用苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis，Bt与蜡状芽孢杆菌Billus cereus，Bc混合发酵，包括下列步骤A、增效菌的筛选，将对苏云金芽孢杆菌Bt和蜡状芽孢杆菌Bc分别接种于发酵培养基进行发酵培养，将发酵培养液以1∶1-8∶1的比例混合后进行生物测定，筛选对苏云金芽孢杆菌Bt有增效作用的蜡状芽孢杆菌Bc菌株；发酵方法首先是活化，将蜡状芽孢杆菌Bc接种于LB斜面上，30℃培养至芽孢脱落；其次是同步化从活化的LB斜面或平板上刮取一环菌，加入装有5ml蒸馏水的试管中摇匀，温度控制在72～76℃，水浴12～15分钟，取出冷却至常温；第三是摇瓶发酵取上述同步化的菌悬液接种于瓶中，摇瓶培养，至15～20％芽孢脱落；B、同活性苏云金芽孢杆菌Bt的拮抗的菌株的剔除，在制备LB平板的过程中加入苏云金芽孢杆菌Bt的芽孢，得到含苏云金芽孢杆菌的平板，然后将蜡状芽孢杆菌Bc菌株，接种于上，30℃培养；C、混合发酵条件，首先是接种比例将苏云金芽孢杆菌Bt与蜡状芽孢杆菌Bc按1∶1～8∶1接种于摇瓶培养基中，30℃，200rpm摇瓶培养；其次是接种时间先接苏云金芽孢杆菌Bt菌株于培养基中，摇瓶培养0-8小时后，再接种蜡状芽孢杆菌Bc菌株，培养40-52小时后，选取两菌株接种间隔时间0-6小时；D、混合发酵，将苏云金芽孢杆菌Bt和蜡状芽孢杆菌Bc按照步骤A进行同步化，按步骤C接种时间和比例接种到摇瓶培养基中发酵培养，以芽孢脱落15～20％为发酵终点，得到的培养物即为混合发酵产物。
全文摘要
本发明公开了一种对农业害虫的高效、无毒、安全以及对环境无污染的微生物农药杀虫剂的制备方法,首先对斜面保藏蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌,斜面活化培养至芽孢脱落;其次是热处理;第三是分别接种;第四是摇瓶发酵培养至芽孢脱落;第五是拮抗菌的剔除;第六是混合发酵;第七是接种时间和比例选择;最后是培养至15－20%芽孢脱落。本发明节约了时间,成本低廉,增效效果大,提高了苏云金芽孢杆菌Bt产品的杀虫效果。
文档编号A01N63/04GK1378784SQ0211570
公开日2002年11月13日 申请日期2002年4月11日 优先权日2002年4月11日
发明者袁志明, 刘铭, 蔡全信, 刘海舟, 阎建平 申请人:中国科学院武汉病毒研究所