专利名称：索尔邦百合组培培养基及其快速繁殖方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种快速繁殖百合组织培养苗的方法，包括选取索尔邦百合外植体部位，诱导、增殖继代、生根培养基配方、培养时间、条件及组培苗移栽的条件。
背景技术：
百合(Lilium tenuifolium Fisch)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)植物的统称，百合是世界著名的观赏花卉，同时又有药用及食用价值。索尔邦百合(Sorbonne)属于东方百合杂种系(The Oriental Hybrids)，为百合中的名贵品种群，由于其花色艳丽、花形奇特、芳香宜人而深受人们的喜爱，成为近年国内外市场热销的花卉种类之一，东方百合是通过杂交育种选育出来的，种子高度败育，常采用传统的鳞茎球繁殖方法，繁殖速度缓慢，在短期内难以满足市场需求，目前国内主要通过进口种球进行生产，为了降低生产成本，实现种球的自主繁育，进行组织培养与快速繁殖已十分必要，并且在百合的优良品种快速繁殖、脱毒复壮、新品种培育以及应用生物技术进行分子育种中，组织培养都是比较合宜的方法，百合许多器官和组织都可进行组织培养诱导成苗，索尔邦百合采用花丝、花托、子房等花器官进行离体培养的研究有报导，但采用鳞茎球快繁的未见报导。而花器官作外植体取材易受开花期的限制，不能常年进行组培生产，而鳞茎球却不受此制约，可连年取材进行组培生产。
组培快繁技术有一些报道如CN1631111斑叶兰组培培养基及其快速繁殖方法，包括基本培养基及分别适用于不同组培阶段的诱导培养基、增殖培养基壮苗培养、基生根培养基。CN1460409A报道了兰州百合的快速繁殖方法，选取兰州百合的鳞片、叶和根的切段，经外植体消毒后，接入含不同植物激素的培养基，诱导产生芽，继代培养后接入生根培养基，当试管苗高3-5cm时移栽入种植练苗，鳞片和不定芽的诱导和繁殖培养基为MS BA2mg/L、NAA0.2mg/L，根、叶诱导和繁殖培养基为MS BA2mg/L、NAA0.4mg/L，试管苗生根培养基为1/2MS NAA0.3mg/L，温度27±2℃，光照为12h.d-1，pH5.8。
上述培养基和方法不能针对索尔邦百合Sorbonne(粉红色)的鳞茎球的鳞片作外植体。国外引进的索尔邦百合其快繁配方明显不同于我国的本土品种兰州百合的快繁方法，而这种索尔邦百合是东方百合中热销的品种，具有良好的观赏和经济价值，因此其快繁方法有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是利用植物组织培养方法，短时间内获得室内大规模繁殖的百合组培苗，或是应用于花卉的工厂化生产，或是用作转基因时转化受体系统，并克服了传统鳞茎繁殖倍数低，速度慢的缺点，同时改变了以花器官为外植体受花期限制的不足，可常年提供组培苗的新的繁殖方法。
本发明的技术方案是选取索尔邦百合鳞片叶为外植体，经消毒后切块接入含不同植物激素的培养基中，诱导培养基诱导出愈伤及芽丛，经继代培养基增殖后，当苗高3-6cm以上并且基部鳞茎球形成时移入生根培养基，经练苗5-8天后移栽入基质中。
本发明所述诱导培养基MS+2，4-D 1.0～2.0mg/L和MS+BA 1.5mg/L+NAA0.2mg/L；增殖培养基为MS+2，4-D 1.0～1.5mg/L和MS+BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L；生根培养基为1/2MS+IBA0.2mg/L和NAA0.2mg/L。培养条件是，培养温度22～26℃，光照度2000～2200lx，最优条件选光照10-14h.d-1，pH5.5-6.2.
本发明以索尔邦百合Sorbonne(粉红色)鳞茎球的鳞片作外植体，经诱导培养基培养后经80-100d，诱导出愈伤与芽丛，增值出新植株，又经继代增值培养基培养约30-40d后愈伤增值又新增出更多的芽及愈伤，长大的苗经生根培养基培养约40-50d后生出大量根系，即再生出完整植株，经练苗移栽入基质中。每次继代增值芽数达到了约2-3倍。即从接入外植体后经历约150-180d(加上生根和练苗时间)芽增殖倍数达到了1∶5～7以上(每个3mm×3mm3的外植体块经历一次继代至少可获得5-7株苗)。该方法繁殖速度快，繁殖倍数大，优于传统的分株繁殖方法。
本发明的特点是利用植物组织培养方法，短时间内获得室内大规模繁殖的优质百合组培苗，可应用于花卉的工厂化生产，本发明确定的三种培养基配方，具有良好的作用。
具体实施例方式
1.百合无菌鳞茎球外植体的处理中国芊卉种苗公司购买的国外进口的百合鳞茎球，先经自来水流水冲洗2h后，用细软毛刷刷去泥土冲洗干净，把鳞茎球中的鳞片叶剥下后，剔出病残者，挑选靠近鳞茎盘基部的幼嫩鳞片叶，用刀修整，剔除菌斑及瑕眦，放入培养皿中待用。在超净工作台上，用75％酒精浸泡30s，用无菌水漂洗后再放入0.1％Agcl2(0.02％吐温)中浸泡5-8min，用无菌水漂洗5次后，放入无菌的培养皿中用灭菌的滤纸吸干水分，切成3mm×3mm的小块作外植体备用。
2.百合组培的培养基及培养条件包括基本培养基附加不同激素组合，适用于不同组培阶段的培养基组成，具体各阶段培养基如下①基本培养基选用MS培养基或1/2MS培养基，以上培养基均加入0.55％琼脂，3％蔗糖，pH5.8，培养温度22～26℃，光照度2000～2200lx，光照12h.d-1；②诱导培养基MS+2，4-D 1.0～2.0mg/L和MS+BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L的一种；③增殖培养基MS+2，4-D 1.0～1.5mg/L和MS+BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L中的一种；④生根培养基1/2MS+IBA0.2mg/L和1/2MS+NAA0.2mg/L中的一种。
3.百合鳞片愈伤、芽的诱导、继代及生根过程在超净工作台上，将由步骤1获得的外植体小块背面朝下放在诱导基①中，在组织培养室中暗培养一周后进行光照培养，20d左右时鳞片表面及切口处出现白色及浅绿色突起，40-45d后在突起中诱导出芽丛，同时基部淡黄绿色愈伤组织长大。培养至80-100d愈伤组织中一部分发出芽丛，还有一部分继续增殖长大，培养至120d时将高度生长至5cm以上并生出鳞茎球的小苗移至生根培养基中生根，其它在诱导培养基中的愈伤组织部分可经切割后移至增殖培养基中继续诱导，继代产生大量的愈伤和芽丛。继代培养每隔30-40d进行一次，每次继代芽的增殖达到了2-3倍，愈伤的增殖达到了3-4倍，增殖循环不断进行下去就达到的扩繁的目的。
在组织培养室培养期间注意观察，随时剔除污染的材料，以免交叉感染。
4.练苗及移栽移入生根培养基中的苗经40-50d生长出大量根系，并且苗基部的鳞茎球发育至直径达3mm，就可敞开瓶口在培养室中练苗。一周后，用流动水清洗干净根系上的培养基，移入事先喷洒过0.2％达克宁的基质(沙∶花肥∶椰糠为1∶1∶1)中，放入培养箱中培养，温度为25℃，平均光照强度2000lx，每日光照12h。每隔两天浇水，培养15d后再移入花盆或大田中生长。
本发明的效果在于1)获得了百合的无菌苗。百合鳞茎本身带有许多杂菌和病毒，该方法经自来水流水冲洗2h后，又经人工用毛刷清洗，初步降低污染，然后通过75％酒精和Agcl2彻底灭菌，在超净工作台上进行系列无菌操作，获得了再生的无菌苗，该无菌苗可用作转基因研究中的转化受体，该方法可达到接种无菌率75％，存活率60％以上。
2)建立了百合组培苗的快速繁殖途径。百合经诱导培养后生出了愈伤和新的芽丛，每隔30-40d继代1次的频率，即从接入外植体后经历约150-180d(加上生根和练苗时间)芽增殖倍数达到了1∶5～7以上(每个3mm×3mm3的外植体块经历一次继代至少可获得5-7株苗)。而每个新生的无菌小苗，可继续进行以上的增殖培养。技术简单，操作方便，而且所用的试剂均为常规化工产品，成本低廉，有利于大规模的工厂化生产。
3)本项发明可不分季节，可随时提供健康的百合无菌小苗。该方法克服传统的鳞茎球繁殖方法繁殖速度缓慢的缺点，即使百合的工厂化生产成为可能，也为转基因等生物工程方面的研究提供无菌小苗或愈伤。
上述实施例说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
1材料与方法如上具体实施方式
中1和2所述2结果2.1百合鳞片不定芽的诱导鳞片块接入培养基在组织培养室中先暗培养7d，约15d左右鳞片颜色由白变成绿色，20d时鳞片表面及切口处出现白色及浅绿色突起，每个鳞片上有数个这种突起，40-45d时突起上长出很密的绿色的芽丛同时鳞片基部出现的愈伤组织并增大，至70-80d已出的芽丛继续长高，而基部愈伤在生长的同时又出现新的芽点及芽丛。至60d(约8周)四个诱导培养基芽的分化率都大于40％。诱导培养情况见表1。芽丛在诱导培养基上能正常生长说明诱导培养基也能继续培养愈伤与芽丛的共生体，培养时的120d(约17周)结果如表2所示。
表1不同激素含量培养基60d诱导芽分化情况
表2诱导培养基上生长120d时芽的生长情况
2.2继代增殖培养120d时，将高度为大于5cm并且基部鳞茎球已形成的苗接入生根培养基，其余的愈伤和小芽丛切成小块，接入不同的芽增殖培养基中继代增殖，培养约40d后，便又形成新的从生芽，同时愈伤还在继续增大，同时芽在长大过程中鳞茎球也在形成、生长，每次继代芽的增殖倍数如表3所示。
表3不同激素含量培养基继代增殖结果
2.3生根将苗高达5cm以上且基部鳞茎球达到直径3mm的无菌苗移入生根培养基中，经40d后，生根情况见表4，其中的效果较好的培养基为1/2MS+NAA0.2mg/L、1/2MS+IBA0.2mg/L。
表4不同激素含量生根培养基继代增殖结果
2.4练苗及移栽移入生根培养基中的苗15d开始生根，经40-50d生长出大量根系，并且苗基部的鳞茎球发育至直径达3mm，就可敞开瓶口在培养室中练苗。一周后，用流动水清洗干净根系上的培养基，移入事先喷洒过0.2％达克宁的基质(沙∶花肥∶椰糠比为1∶1∶1)中，放入培养箱中，温度为25℃，平均光照强度2000lx，每日光照12h。每隔两天浇水管理，15d后再移入花盆或大田中生长。
3讨论 本培养经历初代培养中短暂愈伤阶段很快就进入芽丛阶段，可以说愈伤与芽丛是共生的，MS+2，4-D 1.0～1.5mg/L培养基诱导愈伤效果很好，诱导芽密度大，但苗的健壮成度比在MS+BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L诱导的差。而在MS+BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L继代培养的芽密度中等，增殖倍数较好芽更健壮。因此若为转基因培养时愈伤增殖用MS+2，4-D 1.0～1.5mg/L继代最好，而为获得无菌组培苗可选用MS+BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L继代最好。经诱导培养120d后每隔30-40d进行继代增殖，达到每个外植体新生芽5-7株，其中愈伤增殖倍数也达到了3-4倍。
权利要求
1.索尔邦百合组培培养基及其快速繁殖方法，其特征是该方法由以下步骤组成选取索尔邦百合鳞片叶为外植体，经消毒后切块接入含不同植物激素的培养基中，诱导培养基诱导出愈伤及芽丛，经继代培养基增殖后，当苗高3-6cm以上并且基部鳞茎球形成时移入生根培养基，经练苗5-8d后移栽入基质中。
2.由权利要求1所述的索尔邦百合组培培养基及其快速繁殖方法，其特征是所述诱导培养基采用如下配方MS+2，4-D 1.0～2.0mg/L和MS+BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L；增殖培养基为MS+2，4-D 1.0～1.5mg/L和MS+BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L；生根培养基为1/2MS+IBA0.2mg/L和NAA0.2mg/L。培养条件是，培养温度22～26℃，光照度2000～2200lx，光照10-14h.d-1，pH5.5-6.2。
3.由权利要求1或2所述的索尔邦百合组培培养基及其快速繁殖方法，其特征是组织培养的条件为培养温度22～26℃，光照度2000～2200lx，光照10-14h.d-1
4.由权利要求1或2所述的索尔邦百合组培培养基及其快速繁殖方法，其特征是当移入生根培养基中的苗经40-50d根系生长基本完成，并且苗基部的鳞茎球发育至直径达3mm，就可敞开瓶口在培养室中练苗，一周后，用流动水清洗干净根系上的培养基，移入事先喷洒过0.2％达克宁的基质中，放入培养箱中培养，温度为25℃，平均光照强度2000lx，每日光照12h；每隔两天浇水培养，15d后再移入花盆中生长备用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域。运用组织培养方法，通过室内扩繁获得大量的索尔邦百合无菌组培苗。选取索尔邦百合鳞片叶为外植体，经消毒后切块接入含不同植物激素的培养基中，诱导培养基诱导出愈伤及芽丛，经继代培养基增殖后，当苗高5cm以上并且基部鳞茎球形成时移入生根培养基，经炼苗7天后移栽入基质中。诱导培养基为MS+2，4－D1.0～2.0mg/L和MS+BA1.5mg/L+NAA 0.2mg/L；增殖培养基为MS+2，4－D 1.0～1.5mg/L和MS+BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L；生根培养基为1/2MS+IBA0.2mg/L和NAA0.2mg/L。培养条件是，培养温度22～26℃，光照度2000～2200lx，光照12h.d
文档编号A01G7/00GK1810097SQ20051013497
公开日2006年8月2日 申请日期2005年12月31日 优先权日2005年12月31日
发明者陈建群, 张伟丽, 金欣庆, 袁慧中, 经志强 申请人:南京大学