专利名称：：吗啉化合物在防止细菌污染中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及防止在医疗设备和含流体的储存产品上形成生物被膜。
背景技术：
：生物被膜被简单描述为"包埋于有机聚合物基质中、附着于表面的樣i生物群落"(Carpentier,1993.J.Appl.Bacteriol.75:499—511)。所有生物被膜均含有三种基本成分微生物、糖萼和表面。若除去这其中的一个组分，则生物被膜不能进一步发展。生物被膜可由一种细菌菌种形成，但通常生物被膜由多种细菌菌种与真菌、藻类、原生动物、碎片和腐蚀产物组成。生物被膜可在几乎任何暴露于细菌和一定量水的表面上形成。细菌附着于合适的(生物或非生物)表面和随后发展生物被膜的过程由W.MichaelDunneJr，ClinMicrobiolRev.2002Apr;15(2):155-66所综述。细菌的附着由多个参数决定，包括细菌菌种、表面组成、环境因子和主要的基因产物。简而言之，生物被膜在细菌附着于水环境中的表面并且开始分泌带有粘性的胶状物质时形成，该胶状物质可将其锚定在一系列物质如金属、塑料、土壤颗粒、医疗植入物材料和组织等上。初始粘附通过符合条件的表面(conditionedsurface)和浮游微:生物的偶然相遇而出现。更进一步概括，细菌和非生物表面的初始粘附受非特异性(如疏水性)相互作用介导，而与活组织或失活组织的粘附却通过特异性分子(凝集素、配体或粘附素)对接机制完成。这个阶段是可逆的，由限定细菌细胞表面和符合条件的所研究表面之间的相互作用的物理化学参数所决定。初始粘附之后，会出现锚定阶段，其中结合松散的生物通过产生与表面结合的表多糖巩固附着，由此不可逆转地附着至该表面。一旦细菌不可逆地附着，则开始进入生物被膜的成熟期。由于表面结合的生物活跃地复制(和死亡)，并且(由附着细菌产生的)胞外组分与邻近环境中的有机和无机分子相互作用形成了糖萼，所以生物4皮膜的总体密度和复杂性升高。表多糖形成了糖萼(除水之外)的主要组分，大部分菌种中的糖萼主要是阴离子性的，还能捕获养分并且保护细菌免于环境伤害。就被感染的生物医疗植入物而言，糖萼可包括附着于植入物的、来源于宿主的炎症应答蛋白或基质蛋白如补体、血纤蛋白原和葡胺聚糖等。生物被膜的生长潜力受限于邻近环境中养分的可用性、这些养分向生物被膜内细胞的灌注以及废物的除去。流过生物被膜的具有最佳水动力学的流体有助于最外层的生长和灌注而非侵蚀。调控生物,皮膜成熟的其它因素包括内部pH、氧灌注、碳源和渗透性。在临界质量时达到动态平衡，此时，生长的最外层(距离表面最远)形成了浮游生物。这些生物可自由地脱离生物被膜并在其它表面定居。由于缺乏养分或灌注、pH下降、p02下降或有毒代谢副产物的累积，距离表面最近的细胞开始休眠或死亡。一旦锚定至表面，生物被膜微生物根据周围的环境条件进行多种有害或有益反应(根据人类的标准)。表面微生物生物被膜每年在设备损坏、产品污染、能量损耗和医学感染方面耗费掉数十亿美元。杀伤细菌的常规方法(如抗生素和消毒)通常对于生物被膜细菌无效，这部分是由于糖萼的保护性。除去生物被膜细菌系统所需的大量抗^:生物剂并不环保(并且可能不受环境法规允许)和在医学上并不实用(原因在于杀伤生物被膜细菌所需的量也对患者有副作用)。尽管对阻碍细菌附着的表面或表面包被物已有描述(例如Shengetal，Diagn.Microbiol.Infect.Dis.38:1-5),但是并5殳有开发出防止这种附着的表面或表面包被物(pl-ll，Lappin-ScottandCosterton:MicrobialBiofilms1995.CambridgeUniversityPress)。因此，需要新的方法来控制生物被膜形成。
发明内容本发明基于这样一个认识地莫匹醇(delmopinol)及其衍生物可用来防止或减少生物被膜的形成或确保生物被膜处于非病原性(非活性)状态。这可应用到工业上，包括防止生物被膜在外科手术设备或水储存或送递设备上形成。根据本发明的第一方面，具有式(I)的化合物或其盐可用来防止或减少生物被膜在表面形成，或者防止或减少活微生物在表面生长，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(I)其中l是位于吗啉环2-或3-位的含8至16个碳原子的直链或支链烷基，！U是含2至1()个碳原子的直链或支链烷基，在除a位以外的位置被羟基取代，基团Ri和R2的碳原子数总和至少为10,优选为10至20。根据本发明的第二方面，上述化合物用于在外科手术之间处理手术器具的用途。根据本发明的第三方面，被上述化合物浸渍的药签。根据本发明的第四方面，涂覆有上述化合物的医疗设备。根据本发明的第五方面，涂覆有上述化合物的滤器、输水管或流体储存槽。根据本发明的第六方面，包含上述化合物的容器用于处理表面以防止或减少在所述表面上形成生物被膜，或防止或减少活微生物在所述表面上生长。根据本发明的第七方面，容器含有多个独立的密封包装，每个包装含有单位剂型液体形式的上述化合物。具体实施例方式本发明基于这样一个令人惊喜的发现地莫匹醇及其衍生物可防止或减少生物被膜形成并且/或者可确保任何细菌生物被膜无活性，即处于非存活状态。本文所使用的术语"生物被膜"指的是本领域中该术语公认的含义，即附着于表面的微生物群落以及相关糖萼。本领域存在多个定义，这其中的每个定义均在本发明的范围内。例如，Carpentier(参见上文)将生物被膜描述为"包埋于有机聚合物基质中、附着于表面的樣i生物群落，，；Costerton(1999Science284:1318-1322)将生物被膜描述为"被自身产生的聚合基质包围并粘附于惰性或活性表面的结构化细菌细胞群落，，；Elder(1995Eye9:102-109)以更为协作的术i吾将生物被膜描述为"聚集在大量胞外聚合物(exopolymer)基质内的微生物的功能性聚生体"。用于本发明的化合物具有上述通式(I),其中IU是位于吗啉环2-或3-位的含8至16个碳原子的直链或支链烷基，Rz是含2至10个^Lf、子的直链或支链烷基，在除a位以外的位置被鞋基取代，基团Ri和R2的碳原子数总和至少为10，优选为10至20。在一个优选的实施方案中，所述化合物为地莫匹醇，即3-(4-丙基-庚基)-4-(2-羟乙基)吗啉，一种已知的化合物。用于本发明的化合物的制备方法描述于US4894221，其内容通过援引纳入本文。在下面的描述中提及"防止或减少生物被膜形成"。但是，本发明还包括处理表面以防止或减少"活性"生物被膜的形成。活性生物为以活微生物为特征的生物被膜。因此，提及防止生物被膜形成时，包括防止或减少活微生物复合物或集落的形成或减少这类复合物或集落的形成。"减少"可通过与未处理表面相比较而测量。该化合物可用来处理任何表面。事实上，任何表面——动物、矿物质或植物(即生物的或非生物的)一一均可能适合细菌定居和生物被膜形成，包括接触镜、船体、奶制品和石油管道以及全部类别的生物医疗植入物和经皮设备；因此，该化合物可用来防止生物被膜在这其中的任何一种表面上形成。该化合物在防止在医疗设备上形成生物被膜方面特别有益，所述医疗设备例如外科手术植入物，包括人工关节如髋关节、矫形手术器具如针、盘和线、人工肢体/假肢、心瓣膜、支架、接触镜和用于送递流体、养分和药物或用于除去流体和废物的设备，如导管。为避免分歧，本文所使用术语"医疗设备"包括美容方法所使用的设备和植入物。该化合物还可用来防止在植入受试者的识别标签和信息标签或电子芯片上形成生物^皮膜。本发明的化合物还可用来处理手术器具如外科手术刀、锯、解剖刀、镊子等，或用于侵入性外科手术的任何其它器具。医疗设备可为植入物，即插入受试者体内的i殳备。在一个优选的实施方案中，该设备为外科手术植入物，该植入物需要对身体进行切口来植入。在一个特别优选的实施方案中，待处理装置为牙植入物，如固定牙齿的牙针或牙螺钉。或者，医疗设备与身体相接触但不i^v身体，如假肢、管形石膏、接触镜或外用助听器。就接触镜而言，本发明的化合物可浸渍到该接触镜的表面。或者，就水凝胶型接触镜而言，该化合物可浸渍到水凝g质中。或者，该化合物可存在于用来保存或清洗接触镜的溶液中。植入设备(或与"M目接触)的受试者可为人或动物，即兽医学应用也在本发明范围内。该化合物通常涂覆于待处理的表面或设备上。有很多方法可将该化合物涂覆于合适的物质上，包括喷洒涂覆、辐射和紫外固化。用生物材料涂覆医疗设备的技术现已有所改进，并且这些技术可应用到本发明。因此，本发明包括被涂覆的材料，特别是涂覆有式I的化合物的医疗设备。由于涂覆有式I化合物的滤器或输水管是经涂覆的流体储存或流体送递设备，因此也在本发明的范围内。待涂覆材料可为金属、塑料、陶瓷、聚苯乙烯或玻璃。优选地，待涂覆材料为金属如不锈钢。本发明的化合物可以通过共价键或非共价键连接与被处理表面相结合。若以共价方式结合，则使用连接分子来将该化合物连接至该表面。例如，聚乙二醇(PEG)为可用于本发明的有用连接底物。氨基化也可用来提供有效的连接分子。或者，该化合物可浸渍至基质如聚合物基质中。常规生物相容聚合物基质可用来将该化合物保留在该表面上。例如，poly(organo)phophazene、亲水性水凝胶(如甲基丙烯酸-2-羟乙酯、HEMA)或珪基涂覆物(如氟硅酮)均用作医疗设备上的常规涂覆物，并且可用来保留本发明的化合物。合适的涂覆方法公开于US2005/0187611，其内容通过援引纳入本文。在一个优选的实施方案中，医疗设备在被插入待放置植入物的受试者体内或与受试者(体表)相接触之前或期间与式I化合物相接触。更优选地，该设备在与受试者相接触之前或期间裙J亥化合物冲洗。更优选地，沖洗之后立即与受试者相接触，随后进行干燥使得该化合物涂覆于该i殳备上。本发明的优选实施方案包括包含于容器内的一定量的适合一次施用至医疗设备或其它表面的式I化合物。优选地，容器内表面、其内环境和内含物(如地莫匹醇)是无菌的，即灭菌的，并且基本不含病原体，因此适合用于医学(或美容)手术如外科手术。更优选地，外表面也是无菌的。任何适合容纳液体的容器均可使用，优选容器可被密封。优选的容器为生产时可无菌密封并且在需要时可剪开或撕开的小袋或小包。优选地，小袋可由软塑料或金属材料制备；合适的小袋为本领域所熟知。其它合适的容器包括任何材料的瓶、罐和管，所述材料优选为玻璃或塑料。在一个优选的实施方案中，容器为储存或清洗接触镜的容器。适合不同应用的容器大小(由此预先决定储存在其中的化合物的剂量)对于本领域的技术人员而言是显而易见的，例如，髋关节植入物比(标准)导管需要更大量的地莫匹醇。优选每个容器均"一次性使用"，即一旦将容器打开并使用了内含物，则不管是否使用了所有内含物均将其弃去。这具有将任何可能的污染最小化的优点。本发明的化合物可以任何合适浓度存在于容器中。一般而言，化合物的浓度为0.01%(w/v)至10y。(w/v)，优选O.1%(w/v)至50/。(w/v)，并且最优选1%(w/v)至3。/。(w/v)如2。/。(w/v)。该化合物一般存在于水溶液中，但也可使用包括醇在内的其它任何合适的溶剂。式I化合物可浸渍于用来与防止生物被膜在其上形成的表面相接触的材料之上。该材料可以为纺织品或非纺织品。纺织材料一般用来擦拭表面；合适的纺织材料的非限制性实例包括药签、布料、抹布或墩布。纺织材料可包含天然纤维(如棉花)或合成纤维(如尼龙)，或两者的组合。在一个优选的实施方案中，浸渍材料可为适合用于医疗环境的无菌/灭菌"一次性使用"材料，如绷带。最舞选地，该材料在上述容器中提供；该容器可仅含有该浸渍材料，或含有该浸渍材料和过量适合冲洗表面的化合物(除了将表面与浸渍材料相接触，或者不将表面与浸渍材料相接触)。式I化合物还可用于其它工业应用，此时流体如水将与表面相接触。在一个优选的实施方案中，该化合物用来防止在包括水纯化或运输系统(包括输水管和蓄水池)在内的水或流体送递或储存系统内形成生物被膜。在另一个优选的实施方案中，表面自身由本发明的化合物涂覆或浸渍。该实施方案特别适用于将在固定位置停留较长一段时间的表面，例如上述医疗i殳备和水或流体送递系统。化合物可以常规方式与待处理表面相接触。例如，可将化合物制备为'溶液并将该溶液与表面相接触。化合物可用来冲洗或擦拭上述表面。在一个更优选的实施方案中，该化合物被喷洒至所述表面。在该实施方案中，化合物可在适合产生含所述化合物的滴雾的气溶胶罐、喷雾瓶或其它相似设备中配制。这种方法可以有效地使该化合物与很大的表面相接触。这种方法对于与形状不好处理的表面或精细表面如接触镜相接触而言也特别有效。化合物可以以能获得所需效果的任何合适形式送递。该化合物可包含在控释制剂内或储存于可控释该化合物的装置内。控释制剂可与上述任何其它实施方案一起使用，例如控释制剂可浸渍至表面内或通过喷洒送递。本发明化合物可以其盐的任何形式使用。具体而言，该化合物可为其酸盐形式(如盐酸地莫匹醇)或其在水溶液中的较低溶解度形式。这样即便是在冲洗之后，该化合物依然可保留在处理设备的表面。有效防止生物被膜形成的量对于本领域的技术人员而言是显而易见的，并且可以基于待处理表面而确定。下列非限制性实施例将对本发明进行进一步描述。实施例本研究包括下列测试材料外科用不锈钢316(用于例如心瓣膜)钛(用于例如髋关节植入物)可获得圆片形式的不同材料，圆片的直径约为30mm，厚度约为l咖。然后将这些圆片置于Petri培#底部。满'必合錄将盐酸地莫匹醇溶解于UHQ级水中，使其浓度为20mg/mL(2%w/v)。室温下避光保存该溶液，直至使用。^^^^寧义理^y试4面方法A:用2raL2%的盐酸地莫匹醇水溶液处理测试表面，并在室温下静置15分钟。用移液管除去全部地莫匹醇溶液。然后用4mL磷酸钾緩冲液(10mM，pH7.2)将孔彻底冲洗三次。由于地莫匹醇的pKa为7.1，大部分的化合物都会转化成碱，该碱在水溶液中溶解度非常低，因此在冲洗期间将会停留在表面且不会被完全洗掉。方法B:用2mL2%的盐酸地莫匹醇水溶液处理测试表面，并过夜干燥。録參从皮肤分离到表皮葡萄球菌("a/7At7ococcmep/VerizwW/s)的新鲜菌林并在-80'C于奶粉中保存。进行实验前一天，将细菌转移至血琼脂并在95%h2和5%c02气体中于371c过夜培养。从血琼脂收集集落形成单位并将其悬浮于IOmM磷酸钾緩冲液(pH7.2)，使其光密度在600nm为0.4,这对应约1()8个细胞/mL。才艮据制造商的^兌明书《吏用活/死细菌活力(Live/DeadBacterialViability)方法(MolecularProbes,Inc.Eugene,0R，USA),通过荧光显微镜估算细菌悬浮液的细菌活力(表示为活力百分比)。因此，将SYT09(1.5pL)和^^f匕丙啶(1.5pL)与1mL10mM磷酸緩冲液(pH7.2)混合。将等分为10的一份混合液加入10mL细胞悬浮液，并在1000x荧光显微镜(LeitzAristoplan显微镜，配有卤素灯和470-490nm激光滤光片)下分析，绿色代表活细胞，红色代表死细胞。所有情况下，细胞培养物的活力均大于95%。餘粉浙法将4mL细菌悬浮液加至置于Petri培#^中的涂覆和非涂覆测试表面上。让细胞在37X:附着60分钟。通过用4mL緩冲溶液将表面冲洗三次除去未附着细胞。除去表面上的全部液体并使用上述染料SYTO9和碘化丙啶显现粘附细菌。将10pL的等分混合液加至表面并在避光孵育10分钟后分析。每个圆片取10个视野对附着细胞的显微成像进行分析。用与显微镜连接的数码相机捕获图像并将其用来对各个视野中的附着细胞数目进行平均。使用数学程序MATLAB对附着细胞的数目以及活细胞百分比进行估算。脱离分析法如上所述在涂覆地莫匹醇的表面上制备附着细胞群。为测试细胞是否从具有地莫匹醇的表面脱离，可用溶于水的2%地莫匹醇将表面冲洗三次，随后用荧光显微镜进行分析。I.地莫匹醇包被物对附着的影响使用了三次平行的细菌茵林培养物，并给出不同次数的平均值。附着细胞的总数(活细胞数和非活细胞数)示于表l。比较对地莫匹醇涂覆或未涂覆表面的附着情况。图示出2%盐酸地莫匹醇溶液预处理或未预处理的给定表面上的细胞数目/咖2。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>n.地莫匹醇包4皮物对细菌活力的影响如上所述用三次平行的细菌菌林进行处理并在表2示出不同次数的平均值。比较地莫匹醇涂覆或未涂覆表面上的细菌活力情况。图示出给定测试表面上的活细胞百分比。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>m.处理和未处理表面的附着细菌的生长情况通过将4mLTrypticYeastExtract培养基加至每个孑L内，并在37'C培养，以确定细菌在涂覆和未涂覆表面上生长的能力。结果表明在固体表面上的生长受到地莫匹醇涂覆物抑制(表3)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>总之，地莫匹醇涂覆表面显著降低了附着细胞的活力，并且地莫匹醇显著抑制了表面相关细菌的生长。权利要求1.具有式(I)的化合物或其盐用于防止或减少在表面形成生物被膜或防止或减少活微生物在表面生长的用途，其中R1是位于吗啉环2-或3-位的含8至16个碳原子的直链或支链烷基，R2是含2至10个碳原子的直链或支链烷基，在除α位以外的位置由羟基取代，基团R1和R2的碳原子数总和至少为10，优选为10至20。2.权利要求l的用途，其中所述化合物为地莫匹醇。3.权利要求1或权利要求2的用途，其中所述表面为医疗设备或形成医疗设备的一部分。4.权利要求3的用途，其中所述医疗设备为外科手术植入物。5.权利要求1或权利要求2的用途，其中所述表面为接触镜或形成接触镜的一部分。6.权利要求1或权利要求2的用途，其中所逸表面为流体储存或送递装置。7.权利要求6的用途，其中所述表面为滤器或输水管。8.上述权利要求任一项的用途，其中所述表面由所述化合物浸渍或涂覆。9.上述权利要求任一项的用途，其中所述化合物为控释制剂形式，或包含在可控释所述化合物的设备内。10.含有具有式(I)的化合物或其盐的材料用于防止在表面形成生物被膜的用途。11.权利要求10的用途，其中所述材料为紡织品。12.权利要求1的化合物用于在外科手术之前处理手术器具的用途。13.由权利要求1的化合物浸渍的药签。14.一种医疗设备，其中所述设备由权利要求l的化合物涂覆。15.权利要求14的医疗设备，其中所述化合物为地莫匹醇。16.权利要求14或权利要求15的医疗设备，其中所述医疗设备为外科手术植入物。17.权利要求14或15任一项的医疗设备，其中所述设备为接触镜。18.权利要求14或15的医疗设备，其中所述设备为牙;tt^物、导管、支架、导线或整形假体。19.由权利要求1的化合物涂覆的滤器或输水管。20.—种流体储存或流体送递装置，由权利要求1的化合物涂覆。21.含有权利要求1或权利要求2的化合物的容器，用于处理表面以防止或减少生物被膜在所述表面形成，或防止或减少活微生物在所述表面生长。22.含有多个封闭包装的容器，每个包装含有液体形式的单位剂型的权利要求1或权利要求2的化合物。全文摘要一种式I的化合物用于防止生物被膜在表面形成，其中R<sub>1</sub>是位于吗啉环2-或3-位的含8至16个碳原子的直链或支链烷基，R<sub>2</sub>是含2至10个碳原子的直链或支链烷基，在除α位以外的位置由羟基取代，基团R<sub>1</sub>和R<sub>2</sub>的碳原子数的总和至少为10，优选为10至20。该化合物作为包括支架、导管和线材导板在内的医疗设备的涂覆物或处理物特别有用。文档编号A01N33/08GK101111221SQ200680003714公开日2008年1月23日申请日期2006年2月1日优先权日2005年2月1日发明者J·莱恩,O·T·斯乔丁申请人:辛克莱药物有限公司