专利名称：：提高甘草毛状根次生代谢产物合成量的方法
技术领域：
：本发明涉及一种提高甘草毛状根中次生代谢产物合成量的方法。技术背景甘草是我国重要的传统中药，具有清热解毒、润肺祛痰、缓急止痛、补气益脾胃、调和诸药等功效，被誉为"众药之王"。甘草的主要有效次生代谢产物包括三萜类甘草酸和甘草黄酮，其中甘草酸是非常珍贵的解毒剂，可防治病毒性肝炎、高血脂、癌症和艾滋病等疾病；甘草黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗溃疡、抗衰老、保肝等药理作用。甘草不仅是重要药材，还广泛应用于日用化工品及食品领域，其中甘草酸是一种天然甜味剂，而甘草黄酮是一类天然抗菌剂和防腐剂。然而甘草野生资源的濒临灭绝阻碍了甘草的深入开发利用。随着生物工程技术的不断提高，利用毛状根培养来生产次生代谢产物成为研究热点，其生长迅速，分支多，不需要外源激素，而且比细胞培养容易放大，是药用植物资源可持续发展的有效途径之一。由发根农杆菌感染植物形成的甘草毛状根系统，生长速度快，遗传稳定性好，是生产甘草活性成分的良好培养系统。但是甘草毛状根培养系统仍然存在活性成分低的问题，影响了甘草毛状根的进一步发展放大和工业化。如张荫麟(1990)等报道乌拉尔甘草毛状根的总黄酮含量为干重的0.39%，远远低于生药根的含量2.38%;杜旻(2001)等研究的乌拉尔甘草毛状根黄酮含量也约为0.39%;王裔惟(2004)等检测光果甘草毛状根在生长31d后总黄酮达到最高含量为0.78%;杨世海(2006)等检测了乌拉尔甘草毛状根中各种不同黄酮的含量，其总黄酮的含量约为0.15%。对甘草毛状根中甘草酸成分检测的研究较少，有人报道甘草毛状根中不含甘草酸，如日本高京秀等的研究表明甘草毛状根中含有甘草酸；而一些研究却报道在甘草毛状根中未检测到甘草酸，可能与甘草的品种和来源有关。
发明内容本发明的目的是提供一种提高甘草毛状根中次生代谢产物合成量的方法。本发明所提供的提高甘草毛状根中次生代谢产物合成量的方法，是用可调节细胞渗透压造成干旱胁迫的物质处理液体培养基中的甘草毛状根，得到次生代谢产物含量提高的甘草毛状根。所述可调节细胞渗透压造成干旱胁迫的物质为PEG和/或吐温。所述PEG可为不同聚合程度的聚乙二醇(PEG)包括PEG6000，PEG8000，PEG20000，优选为PEG8000。所述方法中，所述PEG的处理浓度为O.02—0.08g/mL，优选为0.02g/mL;所述吐温的处理浓度为0.01—0.04g/mL，优选为0.02g/mL。所述方法中，所述可调节细胞渗透压的物质处理的时间为6—72小时，优选为6—48小时。所述PEG单独处理的时间为24-72小时，优选为48小时；所述吐温单独处理的时间为6-36小时，优选为24小时。所述方法中，所述液体培养基为MS液体培养基。所述方法中，所述甘草毛状根是将甘草毛状根的根尖部位接种于MS液体培养基中继代培养2—4代得到。所述甘草毛状根的根尖部位为自根尖尖部2-3cm的根尖；所述继代培养每20天换一次培养基。所述方法中，所述次生代谢产物为甘草黄酮。生物体在需氧代谢过程中的氧化还原反应伴有活性氧簇(超氧阴离子自由基、羟自由基、单线态氧、过氧化氢等)生成，可以引发生物膜多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应。损伤膜结构及功能，损伤糖、蛋白质及核酸等生物夫分子，导致功能和代谢紊乱。推测干旱胁迫剌激了甘草细胞的抗氧化防御机制，从而能够刺激黄酮类化合物的大量合成。本发明的方法通过用可调节细胞渗透压造成干旱胁迫的物质处理甘草毛状根实现提高毛状根中次生代谢产物的含量，实验证明，本发明的方法处理后得到的甘草毛状根的总黄酮含量增加44%-55%。本发明的方法为利用甘草毛状根培养体系来快速高效的获得高产甘草有效次生代谢产物提供了新型途径。下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。图1为浓度为0.02g/ml的PEG8000处理甘草毛状根不同时间后总黄酮含量柱形图。图2为不同浓度的PEG8000处理甘草毛状根后总黄酮含量柱形图；图2中1为对照，2为浓度2%(g/ml)的PEG8000处理，3为浓度为4%(g/ml)的PEG8000处理，4为浓度为6%(g/ml)的PEG8000处理，5为浓度为8%(g/ml)的PEG8000处理。图3为相同浓度0.02g/ml、不同种类PEG处理甘草毛状根48h后总黄酮含量柱形图；图3中，1为对照，2为PEG6000，3为PEG8000，4为PEG20000。图4为不同浓度的吐温一80处理甘草毛状根24h后总黄酮含量柱形图；图4中1为对照，2为0.Olg/ral的吐温一80处理，3为0.02g/ml的吐温一80处理，4为0.03g/ml的吐温_80处理，5为0.04g/ml的吐温一80处理。图5为吐温-80、0.02g/ml浓度处理甘草毛状根不同时间后总黄酮含量柱形图。具体实施方式实施例1、用本发明的方法处理乌拉尔甘草毛状根后诱导毛状根中的次生代谢产物的合成和分泌。一、PEG诱导乌拉尔甘草毛状根的次生代谢产物合成本实施例中，以乌拉尔甘草毛状根为材料；以不同聚合程度的聚乙二醇(PEG)包括PEG6000，PEG8000，PEG20000或不同浓度而相同种类的PEG(0,02g/ral-0.2g/ml)处理甘草毛状根。具体操作步骤如下1、将诱导产生的乌拉尔甘草毛状根固体培养中生长旺盛的毛状根白色根尖部位2-3cm切下，接种至含有100mlMS液体培养基的300ml培养瓶里，每瓶毛状根的接种量为lg，其中MS液体培养基里不含任何激素，在温度为25°C，转速为100rpm/rain的摇床上黑暗培养40天左右(大约继代两次)，20天更换一次培养基。2、收集所有步骤1液体培养得到的甘草毛状根，除去褐化死亡的毛状根，其余毛状根平均分配到300ml培养瓶里，每瓶毛状根湿重为2g，分成8组，各加入100ml含有不同种类而相同浓度PEG(PEG6000，PEG8000，PEG20000，浓度均为0.02g/ml)或不同浓度而相同种类PEG(0.02g/ml，0.04g/ml，0.06g/ml，0.08g/ml或O.lg/ml)的MS培养基，然后每组分成三小组，分别在与前面继代培养相同的条件下即温度为25°C，转速为100rpm的摇床上诱导处理24、48或者72小时，以不含PEG诱导子的MS培养液处理相同时间的毛状根为对照(CK)。二、PEG处理后甘草毛状根中总黄酮含量的检测。1、将步骤一各组PEG处理后的甘草毛状根及对照毛状根，分别以无菌水冲洗三次，去除残留的培养基，于滤纸上吸干水分，放入6(TC烘箱里烘至恒重，粉碎后过60目筛，称取O.lg粉末，加入5ml甲醇，浸泡过夜(约12小时)，超声波(40Hz)提取30分钟，抽滤，滤渣再重复操作一次，合并滤液，定容至10ml。2、紫外分光光度法检测步骤l得到的各组样品中的总黄酮含量(以质量百分含量表示)。以柚皮苷为标准样品，作标准曲线。根据标准曲线计算所测样品的浓度，从而计算0.lg甘草毛状根粉末中总黄酮的质量百分含量。经紫外分光光度法检测结果如表1-表3(相应柱形图如图1-图3所示)所示，结果表明1)浓度为0.02g/ml的PEG8000处理乌拉尔甘草毛状根不同时间后，从24h至72h之间毛状根中总黄酮含量均有提高，尤其以48h的毛状根中总黄酮含量最高(如表l、图l所示)。表1.浓度为0.02g/ml的PEG8000处理的乌拉尔甘草毛状根的总黄酮含量项目总黄酮含量(质量百分含量％)处理时间24h48h72h对照(ck)1.021.041.03PEG8000(0.02g/ml)1.41.641.372)相同种类而不同浓度PEG处理后的毛状根中，总黄酮含量从0.02g/ml-0.08g/ralPEG处理均有提高，但是有效提高范围为0.02g/ml至0.06g/ml之间，尤其以PEG浓度为0.02g/ml处理48小时后为最高，总黄酮含量比对照提高了44%(如表2、图2所示)；图2中1为对照，2为浓度2%(g/ml)的PEG8000处理，3为浓度为4%(g/ml)的PEG8000处理，4为浓度为6%(g/ml)的PEG8000处理，5为浓度为8%(g/ml)的PEG8000处理。表2.PEG8000处理不同时间的乌拉尔甘草毛状根的总黄酮含量项目总黄酮含量(质量百分含量％)PEG8000浓度(g/ml)2%4%6%8%对照(ck)1.330PEG80001.9201.8021.6971.5013)不同种类而相同浓度(均为0.02g/ml)PEG处理48h后的毛状根中总黄酮含量不同，且以PEG8000处理后的总黄酮含量最高(如表3、图3所示)比对照提高了55.20%。图3中，l为对照，2为PEG6000，3为PEG8000，4为PEG20000。表3.不同种类PEG处理的乌拉尔甘草毛状根的总黄酮含量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2、吐温-80处理甘草毛状根后总黄酮含量检测按照实施例1的步骤一中的步骤1的方法培养得到液体培养的甘草毛状根，然后将该液体培养的甘草毛状根经过两次继代(MS培养基，温度为25'C，转速为100rpm的摇床上黑暗培养)生长后，收集所有毛状根，除去褐化死亡的毛状根，其余毛状根平均分配到300ral培养瓶里，每瓶毛状根湿重为2g，各加入100ml含有不同浓度吐温-80(0.01g/ml、0.02g/ml，0.03g/ral或0.04g/ml)的MS培养基，在与前面继代培养相同条件下诱导处理6、12、24及36小时，以不含诱导子的MS培养液处理相同时间的毛状根为对照(ck)。按照实施例1的步骤二的方法检测处理后的甘草毛状根及对照毛状根的总黄酮含量，结果如表4、表5(其柱形图为图4、图5)所示，结果表明(1)不同浓度的吐温一80处理的毛状根中，从0.01g/ml至0.04g/ml处理的总黄酮含量均有提高，尤其以浓度为0.02g/ml的吐温_80处理24h的最高，比对照高47.30%(如表4、图4所示，图4中1为对照，2为0.01g/ml的吐温—80处理，3为0.02g/ml的吐温一80处理，4为0.03g/ml的吐温一80处理，5为0.04g/ml的吐温一80处理)表4.不同浓度吐温处理后的甘草毛状根的总黄酮含量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(2)以浓度为0.02g/ml的吐温-80处理不同时间段的毛状根中，从6h到36h处理的总黄酮含量均有提高，尤其以24h的最高，高于对照的49%(如图5、表5所示)。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1、一种提高甘草毛状根中次生代谢产物合成量的方法，是用可调节细胞渗透压造成干旱胁迫的物质处理液体培养基中的甘草毛状根，得到次生代谢产物含量提高的甘草毛状根。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述可调节细胞渗透压造成干旱胁迫的物质为PEG和/或吐温。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述PEG的处理浓度为0.02一O.08g/mL;所述吐温的处理浓度为0.Ol—O.04g/mL。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述PEG的最佳处理浓度为0.02g/mL;所述吐温的最佳处理浓度为0.02g/mL。5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述可调节细胞渗透压的物质处理的时间为6—72小时，优选为6—48小时。6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述PEG单独处理的时间为24-72小时，优选为48小时；所述吐温单独处理的时间为6-36小时，优选为24小时。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述液体培养基为MS液体培养基。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述甘草毛状根是将甘草毛状根的根尖部位接种于MS液体培养基中继代培养2—4代得到。9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述甘草毛状根的根尖部位为自根尖尖部2-3cm的根尖；所述继代培养每20天换一次培养基。10、根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其特征在于所述次生代谢产物为甘草黄酮。全文摘要本发明公开了一种提高甘草毛状根中次生代谢产物合成量的方法。该方法，是用可调节细胞渗透压造成干旱胁迫的物质处理液体培养基中的甘草毛状根，得到次生代谢产物含量提高的甘草毛状根。所述可调节细胞渗透压的物质为PEG和/或吐温。本发明的方法通过用可调节细胞渗透压造成干旱胁迫的物质处理甘草毛状根实现提高毛状根中次生代谢产物的含量，实验证明，本发明的方法处理后得到的甘草毛状根的总黄酮含量增加44％-55％。本发明的方法为利用甘草毛状根培养体系来快速高效的获得高产甘草有效次生代谢产物提供了新型途径。文档编号A01N31/00GK101263811SQ200810006938公开日2008年9月17日申请日期2008年1月25日优先权日2007年2月8日发明者刘敬梅,骅周,张海超,毅李申请人:北京未名凯拓作物设计中心有限公司