专利名称：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种短小芽胞杆菌，具体地说，是一种分离于西藏具促生和防病作用 的低温适生短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCm及其在防治番茄灰霉病害中的应用。
背景技术：
番茄灰霉病是由半知菌亚门真菌、灰葡萄孢菌侵染所致，主要为害花和果实，亦可 为害叶片与茎；幼果染病较重，柱头和花瓣多先被侵染，后向果实转移，果实病变多从果柄 处向果面扩展，致病果皮呈灰白色、软腐，病部长出大量灰绿色霉层，严重时果实脱落，严重 影响着保护地蔬菜尤其是番茄的生产。目前对于番茄灰霉病的防治主要是通过喷洒化学试 剂，但是化学农药的大量使用不仅造成了空气、水源、土壤和食物的污染，更重要的是经过 化学农药的定向选择使病原菌产生了抗药性，人们迫切希望能够在生物领域寻找到低毒、 高效、环境友好的新型农药。植物根围促生细菌(PlantGrowth-Promoting Rhizobacteria, 简称PGPR)因为与植物之间具有良好的互利共生关系，不仅能够诱导植物产生抗病性，而 且可以促进植物生长、提高作物产量，因而成为倍受瞩目的一类生防细菌，但是目前未见专 门用于防治番茄灰霉病的生防细菌的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种对于对半知菌亚门真菌、灰葡萄孢菌等病原菌有显著抑 菌效果、并能有效防治番茄灰霉病和促进作物生长的短小芽孢杆菌。上述目的是通过如下技术手段实现的一种短小芽孢杆菌，分类命名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)NMCNl，保藏单 位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏日2009年11月 2 日，保藏号CGMCC No. 3377。短小芽孢杆菌(Bacillus pumi lus) NMCNl CGMCC No. 3377，是从西藏纳木错湖湖 边泥土中分离，经平板对峙筛选获得。短小芽孢杆菌(Bacillus pumi lus) NMCNl CGMCC No. 3377为革兰氏阳性细菌，杆 状，能在10°C生长，是一种低温适生菌，但是不能在50°C生长，能耐受PH5. 7和7% NaCl的 培养，接触酶试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖发酵和酪素试验均为阳性，淀粉水 解试验、硝酸盐还原试验、厌氧生长试验和丙酸盐利用试验均为阴性。利用PCR技术扩增短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)匪CN1CGMCC No. 3377 的 16S rDNA序列，获得长度为484bp的片段，将测试结果(如序列表所示)与GenBank中已知的 16S rDNA进行同源性比较，发现与Bacillus pumilus GQ911554. 1的相似性最高，为99%。根据菌体的革兰氏染色、菌落的形态特征、菌株的生理生化性质以及16S rDNA序 列分析的结果，参照《芽孢杆菌属》(蔡妙英等译，农业出版社，1988年)和《微生物分类学》 (张继忠，上海复旦大学出版社，1995年)的检索表进行检索，将该菌株鉴定为短小芽孢杆 菌(Bacillus pumilus)，命名为匪CNl。
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含有短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCNl CGMCCNo. 3377的菌剂也属于本发 明的保护范围。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)匪CNl CGMCC No. 3377菌株的应用方法为发酵
培养一稀释一喷洒一效果测定。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCNl CGMCC No. 3377的发酵培养基组成 为葡萄糖 20g/L，L-谷氨酸 5g/L，MgSO4O. 5g/L，KCl 0. 5g/L，KH2PO4 lg/L，Fe2SO4 · 6H20 0. 15mg/L, MnSO4 · H2O 5. Omg/L, CuSO4 · 5H20 0. 16mg/L，其余为过滤水，并调节至 pH7. 0。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCNl CGMCC No. 3377对半知菌亚门真菌、灰 葡萄孢菌和酵母菌有显著的抑菌效果，能明显促进番茄的生长。
图1为实施例2短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)匪CN1CGMCC No. 3377的芽胞 图片；图2为实施例9短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)匪CN1CGMCC No. 3377对于真 菌酵母菌的抑菌效果图片。
具体实施例方式以下通过具体实施方式
进一步描述本发明，由技术常识可知，本发明也可通过其 它的不脱离本发明技术特征的方案来描述，因此所有在本发明范围内或等同本发明范围内 的改变均被本发明包含。实施例1:采用五点取样法，用小铲子除去表土，于5 25mm处采取土样几十克，装入采样袋 内，标记好采样时间、地点、植被。称取5g 土样，放入45ml生理盐水中，摇床上震荡30分钟， 静置使澄清。吸取上清液分别用无菌水稀释川人川入川入川人川”五个浓度梯度』。！^ 浴lOmin。吸取200 μ 1涂LB平板，37°C过夜培养。待平板上长出菌落后，挑取单菌落，划线 纯化后编号保存。筛选得到短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCNl CGMCCNo. 3377。实施例2:对实施例1的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No. 3377进行形态 特征观察和生理生化特征鉴定，结果表明，该菌为革兰氏阳性，杆状，产芽孢(如图1所示)。 能在10°C生长，但是不能在50°C生长，能耐受pH5. 7和7% NaCl的培养，接触酶试验、V-P试 验、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖发酵和酪素试验均为阳性，淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、 厌氧生长试验和丙酸盐利用试验均为阴性。实施例3:将实施例1的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)匪CN1CGMCC No. 3377接种于液 体LB培养基，180rpm，37°C震荡培养10小时，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶和SDS破 壁，采用酚-氯仿法提取基因组DNA。以提取到的总DNA为模板，用正向引物PRB1601(5，-G GATCCTAATACATGCAAGTCGAGCGG-3，)和反向引物PRB1602 (5，-GGATCCACGTATTACCGCGGCTGCT GGC-3，)对菌株的 16S rDNA基因进行PCR扩增。PCR条件为95°C，4min ；94°C，lmin ；50°C, Imin ；72°C,2min ；34cycle ；72°C，lOmin，4°C保存。PCR产物回收以后进行测序，经确认其长度为484bp，测序结果如序列表所示，在GenBank中与Baci 1 Ius pumi lusGQ911554.1相似性 为 99%。实施例4 培养基IC培养基 土壤浸出液 主要培养基 将实施例1的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)匪CN1CGMCC No. 3377接种到上 述液体培养基中，37°C培养过夜，取5ul菌液点到距离固体培养基平板中心2. 5cm的十字交 叉点，每个菌株5个重复，分别放置在4°C、10°C、14°C、18°C、30°C的培养箱中培养，每天记 录菌株的生长情况，共记录15天。结果表明，本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) NMCNl CGMCC No. 3377能在温度彡10°C的环境中生长，将在此温度下，能在一周内显现菌 落的菌株记为低温生长菌株，得到低温适生短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus) NMCNl CGMCC No.3377。实施例5 将实施例1的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)匪CN1CGMCC No. 3377接种在 LB培养基上，过夜培养，然后将活化的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCNl CGMCC No. 3377转接到Landy培养基中进行摇瓶发酵，温度为30°C，摇床转速为200rpm，发酵时间 为38小时，得短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No. 3377的发酵液。
其中发酵培养基组成为20g葡萄糖，5g L-谷氨酸，0.5gMgS04，0.5g KCl，Ig KH2PO4,0. 15mg Fe2SO4 · 6H20, 5. OmgMnSO4 · H20,0. 16mg CuSO4 · 5H20，用过滤水补足至总体积 为1L，调节至pH7. 0。实施例6 采用平板对峙法，倒好PDA平板，在平板中央放置直径Icm的番茄灰霉病菌菌块， 在其四周距离2cm处对称放置四个滤纸片，在滤纸片上打5μ 1实施例1的短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus) NMCNl CGMCC No. 3377的菌悬液，重复三次，在25°C光照培养箱中培 养5天，结果显示抑菌圈平均直径为18mm，即本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) NMCNl CGMCC No. 3377对于番茄灰霉病菌的抑菌效果显著。实施例7 拟南芥种子经次氯酸钠(有效Cl含量为5%)表面消毒后，播种到MS培养基平板 (9cm)上，温室培养一周备用。将实施例4的低温适生短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)匪CNl CGMCC No. 3377 接种到LB液体培养基中培养过夜，测定OD值后，将其浓度定量为105CfU/ml，拟南芥种苗用 菌液浸根5min后，种到MS平板(20 X 20cm)上，每个平板4颗苗，每个菌株设置3个重复。 温室培养21d，取出平板称量每颗拟南芥的鲜重。阴性对照组为新鲜液体培养基浸根的拟 南芥，阳性对照组为FZB42浸根的拟南芥。试验结果用浓度为105CfU/ml的菌悬液处理的 拟南芥平均鲜重为0. 01598g，阴性对照组的拟南芥平均鲜重为0. 0097g,阳性对照组的拟 南芥平均鲜重为0. 01598g。即本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)匪CNl CGMCC No. 3377对拟南芥有很好的促生效果。实施例8:将实施例4的低温适生短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)匪CNl CGMCC No. 3377 接种到LB液体培养基中培养过夜，测定OD值后，将浓度分别定量在107CfU/ml、106CfU/ml、 105cfu/ml和104cfu/ml，分别取不同浓度的细胞悬浮液IOml与1 %的羧甲基纤维素30ml配 制成混合液，备用；将经过表面消毒(75%酒精消毒5min，次氯酸钠(有效Cl含量为5% ) 消毒5min，灭菌水清洗3 5次)的玉米种子浸泡在前述不同浓度的混合液中，每个浓度 10粒种子，三个重复，2h后取出种子过夜吹干，然后放在铺有湿润滤纸的培养皿中，30°C暗 处培养；2d后记录萌发种子数，6d后测量种子鲜重，芽长，根长。对照组为用新鲜培养基和 粘附剂的混合液浸种。结果表明用浓度为104CfU/ml的菌悬液处理玉米种子时，芽平均长 度为2. 66cm，而对照组的芽平均长度为2. 3cm ；用浓度为107cfu/ml的菌悬液处理玉米种子 时根的平均长度为2. 533cm，而对照组的芽平均长度为2. 3cm。即本发明的短小芽孢杆菌 (Bacilluspumilus)NMCNl CGMCC No. 3377对玉米种子萌发的促生作用良好。实施例9 将实施例4的低温适生短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)匪CNl CGMCC No. 3377 接种到IC培养基中培养8h后，以1 100的比例转接到IOml的Landy培养基中，发酵约 40小时，离心收集上清液，4°C贮藏备用。将待测真菌菌株酵母菌接种到适宜培养基中培养过夜，测定OD值后将菌液稀 释到107cfu/ml，混合培养基制成含菌平板。待冷却完全后，十字交叉打孔(距平板中心 2. 5cm)，接种低温适生短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCNl CGMCC No. 3377 于 Landy培养基发酵上清液。放置室温下培养2d，观察抑菌效果。结果如图2所示，抑菌圈直径为 40mm,即本发明的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)NMCm CGMCC No. 3377对真菌酵母菌有 显著的抑制作用。实施例10 番茄种子用清水浸泡2h，于28°C潮湿条件下催芽，播种于装有无菌土壤的花盆 中，待番茄苗长到5片真叶的时候，用菌悬液灌根，平均每株番茄苗浇20ml实施例5的短小 芽孢杆菌(Bacilluspumilus)NMCNl CGMCC No. 3377 菌液(浓度为 108cfu/ml)，以后隔 3 天 浇灌该菌液一次，共3次，用清水做对照。两周后抽取10株苗，测定株高、根长和植株鲜重。 结果显示，经菌液处理过的番茄苗明显比对照长势好。经测定，株高增加率达37%，根长增 加率达到2. 6%，鲜重增加率达到129. 1%。即本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) NMCNl CGMCC No. 3377菌株对番茄有明显的促生作用。实施例11 将实施例5的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No. 3377的发酵液 稀释100倍，在番茄开花前十天开始以喷雾形式喷发酵液，以后每间隔7天喷一次，连续喷3 次。对于番茄灰霉病的防治效果可达75%，增加番茄产量12%。即本发明的短小芽孢杆 菌(Bacillus pumilus)NMCNl CGMCC No. 3377能明显抑制番茄灰霉病，并能有效促进番茄 生长、增加番茄产量。序列表 TGAGCGTAGTTGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCGAGCAGTTACTCTCCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGACAGCCGAAACCGTCTTTCATCCTTGAACCATGCGGTTCAAGGAACTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCCGGGAGCAAGCTCCCTTCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGATCCAA
权利要求
一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2009年11月2日，保藏号为CGMCC No.3377。
2.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)NMCNl CGMCC No. 3377， 其特征在于，是从西藏纳木错湖湖边泥土中分离，经平板对峙筛选获得。
3.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)NMCNl CGMCC No. 3377，其 特征在于，革兰氏染色阳性，杆状，能产芽孢，能在10°C生长，但是不能在50°C生长，能耐受 PH5. 7和7% NaCl的培养，接触酶试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖发酵和酪素试 验均为阳性，淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、厌氧生长试验和丙酸盐利用试验均为阴性。
4.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)NMCNl CGMCC No. 3377， 其特征在于，其16S rDNA的部分核苷酸序列如序列表所示。
5.权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)NMCN1CGMCC No. 3377的应用 方法，其特征在于，包括发酵培养一稀释一喷洒一效果测定四个步骤。
6.根据权利要求5所述的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)NMCNl CGMCC No. 3377的 应用方法，其特征在于，所述发酵培养过程中的发酵培养基组成为葡萄糖20g/L，L-谷氨 酸 5g/L，MgS04 0.5g/L，KCl 0. 5g/L, KH2PO4 lg/L，Fe2SO4·6Η20 0. 15mg/L, MnSO4'H2O 5. Omg/ L，CuSO4 ‘ 5H20 0. 16mg/L，其余为过滤水，并调节至pH7. O。
7.权利要求1 4任意一项的短小芽孢杆菌(Baci1 Ius pumi lus) NMCNl CGMCC No. 3377在抑制番茄灰霉病菌和促进番茄生长、增加番茄产量中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2009年11月2日，保藏号为CGMCC No.3377。本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NMCN1CGMCC No.3377是一种从西藏纳木错湖湖边泥土中分离得到的生防芽孢杆菌，可以在10℃的条件下生长，有利于发挥其促生和生防作用，能够抑制番茄灰霉病的病原菌和酵母菌，还能够促进拟南芥和番茄的生长，特别是对于番茄灰霉病的防治效果高达75％，同时增加番茄产量达12％。
文档编号A01P3/00GK101928681SQ20091022335
公开日2010年12月29日 申请日期2009年11月19日 优先权日2009年11月19日
发明者伍辉军, 刘芳, 沈波, 薛鹏琦, 高学文 申请人:无锡亚克生物科技有限公司