专利名称：简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种简单纯芽胞杆菌，具体地说，是一种分离于西藏具促生和防病作 用的低温适生简单纯芽孢杆菌(BaCillUSSimplex)RJGP41及其在防治大白菜软腐病害中 的应用。
背景技术：
大白菜软腐病是大白菜三大病害之一，是由欧文氏菌引起的，这种细菌普遍存 在于土壤里，靠雨水和灌溉水传播，病菌只要与白菜伤口接触，就能侵染发病，如不及 时防治，将会直接影响大白菜的产量和品质。目前对于作物细菌病害包括大白菜软腐 病缺乏有效的化学药剂，而且化学农药的大量使用不仅造成了空气、水源、土壤和食物 的污染，更重要的是经过化学农药的定向选择使病原菌产生了抗药性，人们迫切希望 能够在生物领域寻找到低毒、高效、环境友好的新型农药。植物根围促生细菌(Plant Growth-PromotingRhizobacteria,简称PGPR)因为与植物之间具有良好的互利共生关系， 不仅能够诱导植物产生抗病性，而且可以促进植物生长、提高作物产量，因而成为倍受瞩目 的一类生防细菌，开发和利用专门用于防大白菜软腐病的生防细菌具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种对于大白菜软腐病害具有较好防治效果、并能有效促进 作物生长的简单纯芽孢杆菌。上述目的是通过如下技术方案实现的一种简单纯芽孢杆菌，分类命名为短小芽孢杆菌(BaCilluSSimpleX)RJGP41，保藏 单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏日2009年11 月 2 日，保藏号CGMCC No. 3381。简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41 CGMCC No. 3381是从西藏日喀则市 江当乡郭安村的蒲公英根围土中分离，经平板对峙筛选获得。简单纯芽孢杆菌(Bacilluss implex)RJGP41 CGMCC No. 3381为革兰氏阳性细菌， 杆状，能在4°C生长，但不能在50°C生长，不能耐受pH5. 7和7% NaCl的培养，接触酶试验、 淀粉水解试验、柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验、葡萄糖发酵和酪素试验均为阳性，V-P 试验、厌氧生长试验和丙酸盐利用试验均为阴性。利用PCR技术扩增简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex) RJGP41 CGMCC No. 3381 的 16S rDNA序列，获得长度为481bp的片段，将测试结果(如序列表所示)与GenBank中已 知的16S rDNA进行同源性比较，发现与Bacillus simplex FJ455076. 1的相似性最高，为 94%。根据菌体的革兰氏染色、菌落的形态特征、菌株的生理生化性质以及16S rDNA序 列分析的结果，参照《芽孢杆菌属》(蔡妙英等译，农业出版社，1988年)和《微生物分类学》 (张继忠，上海复旦大学出版社，1995年)的检索表进行检索，将该菌株鉴定为简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)，命名为 RJGP41。含有简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41C GMCC No. 3381的菌剂也属于 本发明的保护范围。简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41 CGMCC No. 3381的应用方法为发酵 培养一稀释一喷洒一效果测定。简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41 CGMCC No. 3381的发酵培养基组成 为葡萄糖 20g/L，L-谷氨酸 5g/L，MgS040. 5g/L，KC1 0. 5g/L，KH2P04 lg/L，Fe2S04 6H20 0. 15mg/L, MnS04 H20 5. Omg/L, CuS04 5H20 0. 16mg/L，其余为过滤水，并调节至 pH7. 0。简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41 CGMCC No. 3381对欧文氏菌有显著 的抑菌效果，对拟南芥、玉米和大白菜有显著的促生效果。
图 1 为实施例 2 简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex) RJGP41 CGMCC No. 3381 的芽 胞图片；图 2 为实施例 6 简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex) RJGP41 CGMCC No. 3381 对于 大白菜根腐病菌的抑菌效果图片。
具体实施例方式以下通过具体实施方式
进一步描述本发明，由技术常识可知，本发明也可通过其 它的不脱离本发明技术特征的方案来描述，因此所有在本发明范围内或等同本发明范围内 的改变均被本发明包含。实施例1:采用五点取样法，用小铲子除去表土，于5 25mm处采取土样几十克，装入采样 袋内，标记好采样时间、地点、植被。称取5g 土样，放入45ml生理盐水中，摇床上震荡30分 钟，静置使澄清。吸取上清液分别用无菌水稀释10_\ 10_2、10_3、10_4、10_5五个浓度梯度，80°C 水浴lOmin。吸取200ia涂LB平板，37°C过夜培养。待平板上长出菌落后，挑取单菌落，划 线纯化后编号保存，筛选得到简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41 CGMCCNo. 3381。实施例2:对实施例1的简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41 CGMCC No. 3381进行形 态特征观察和生理生化特征鉴定，结果表明，该菌为革兰氏阳性，杆状，产芽孢(如图1所 示)。能在4°C生长，但不能在50°C生长，不能耐受pH5.7和7%NaCl的培养，接触酶试验、 淀粉水解试验、柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验、葡萄糖发酵和酪素试验均为阳性，V-P 试验、厌氧生长试验和丙酸盐利用试验均为阴性。实施例3:将实施例1的简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41 CGMCC No. 3381接种于 液体LB培养基，180rpm, 37°C震荡培养10小时，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶和SDS破 壁，采用酚-氯仿法提取基因组DNA。以提取到的总DNA为模板，用正向引物PRB1601 (5’-GG ATCCTAATACATGCAAGTCGAGCGG-3，)和反向引物PRB1602 (5，-GGATCCACGTATTACCGCGGCTGCTGG C-3，)对菌株的 16S rDNA基因进行P CR扩增。PCR条件为95°C，4min ；94°C,lmin ；50°C,Imin ；72°C,2min ；34cycle ；72°C，lOmin，4°C保存。PCR产物回收以后进行测序，经确认其长 度为481bp，测序结果如序列表所示，在GenB ank中与Bacillus simplexFJ455076. 1的相 似性为94%。实施例4 培养基IC培养基 土壤浸出液 主要培养基 将实施例1的简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP4ICGMCC No. 3381接种 到上述液体培养基中，37°C培养过夜，取5ul菌液点到距离固体培养基平板中心2. 5cm的 十字交叉点，每个菌株5个重复，分别放置在4°C、10°C、14°C、18°C、3(TC的培养箱中培养， 每天记录菌株的生长情况，共记录15天。结果表明，本发明的简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41 CGMCC No. 3381能在温度彡10°C的环境中生长，将在此温度下能在一 周内显现菌落的菌株记为低温生长菌株，得到低温适生短小芽孢杆菌Bacillussimplex NMCC46C GMCC No. 3378，经进一步测试该菌株可以在4°C的条件下生长。实施例5 将实施例1的简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP4ICGMCC No. 3381接种在 LB培养基上，过夜培养，然后将活化的简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex) RJGP41 CGMCC No. 3381转接到Landy培养基中进行摇瓶发酵，温度为30°C，摇床转速为200rpm，发酵时间为38小时，得简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41 CGMCC No. 3381的发酵液。其中发酵培养基的组成为20g葡萄糖，5g L-谷氨酸，0.5gMgS04，0.5g KCl, Ig KH2PO4,0. 15mg Fe2SO4 · 6H20, 5. OmgMnSO4 · H20,0. 16mg CuSO4 · 5H20，用过滤水补足至总体积 为1L，调节至pH7. 0。实施例6 采用平板对峙法，在150ml的NA培养基中加入培养好的大白菜软腐病病菌5ml， 倒NA平板，每个平板放四个灭菌的滤纸片，然后吸取5μ 1的实施例1的简单纯芽孢杆菌 (Bacillus simplex)RJGP41 CGMCC No. 3381的菌悬液打在滤纸片上，重复3次，以观察简 单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41 CGMCC No. 3381对大白菜软腐病菌的抑菌效 果。结果如图2所示，菌落直径为1.0cm，抑菌圈直径为1.6cm，即本发明的简单纯芽孢杆菌 (Bacillussimplex)RJGP41 CGMCC No. 3381对大白菜软腐病菌有显著的抑菌效果。实施例7 拟南芥种子经次氯酸钠(有效Cl含量为5%)表面消毒后，播种到MS培养基平板 (9cm)上，温室培养一周后备用。将实施例4的低温适生简单纯芽孢杆菌(Baci 1 Ius simplex) RJGP41 CGMCC No. 3381接种到LB液体培养基中培养过夜，测定OD值后，将其浓度定量为105cfu/ml，拟南 芥种苗用菌液浸根5min后，种到MS平板(20X20cm)上，每个平板4颗苗，每个菌株设置3 个重复。温室培养21天，取出平板称量每颗拟南芥的鲜重。阴性对照组为新鲜液体培养 基浸根的拟南芥，阳性对照组为FZB42浸根的拟南芥。试验结果用浓度为105CfU/ml的菌 悬液处理的拟南芥平均鲜重为0. 018386g,阴性对照组的拟南芥平均鲜重为0. 0097g,阳性 对照组的拟南芥平均鲜重为0. 033789g,即本发明的简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex) RJGP41 CGMCC No. 3381对拟南芥有很好的促生效果。实施例8:将实施例4的低温适生简单纯芽孢杆菌(Baci 1 Ius simplex) RJGP41 CGMCC No. 3381接种到LB液体培养基中培养过夜，测定OD值后，将浓度分别定量在107cfu/ml、 106cfu/mlU05cfu/ml和104cfu/ml，分别取不同浓度的细胞悬浮液IOml与的羧甲基纤 维素30ml配制成混合液，备用；将经过表面消毒(75%酒精消毒5min，次氯酸钠(有效Cl 含量为5% )消毒5min，灭菌水清洗3 5次)的玉米种子浸泡在前述不同浓度的混合液 中，每个浓度10粒种子，三个重复，2h后取出种子过夜吹干，然后放在铺有湿润滤纸的培养 皿中，30°C暗处培养；2d后记录萌发种子数，6d后测量种子鲜重，芽长，根长。对照组为用新 鲜培养基和粘附剂的混合液浸种。结果表明用浓度为105CfU/ml的菌悬液处理玉米种子 时，芽平均长度为2. 829cm，而对照组的芽平均长度为2. 457cm ；用浓度为104cfu/ml的菌悬 液处理玉米种子时，根的平均长度为7. 838cm，平均鲜重为0. 885g ；而对照组的根平均长度 为4. 485cm，平均鲜重为0. 762g。即本发明的简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41 CGMCC No. 3381对玉米种子萌发的促生作用良好。实施例9 白菜种子用清水浸泡2h，于28°C潮湿条件下催芽后播种于装有无菌土壤的花盆 中，待白菜苗长到3片真叶的时候，用菌悬液灌根，平均每株大豆苗浇20ml实施例5的简 单纯芽孢杆菌(Bacillussimplex) RJGP41 CGMCC No. 3381 的菌液(浓度为 108cfu/ml)，三天后再浇灌该菌液一次，用清水做对照。两周后抽取10株苗，测定株高、根长和植株鲜重。 结果显示，经菌液处理过的白菜苗明显比对照长势好。经测定，株高增加率达到56. 63%， 根长增加率达到4. 94%，鲜重增加率达到112.8%，即本发明的简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41 CGMCC No. 3381对大白菜有明显的促生作用。实施例10 将实施例5的简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex) RJGP4ICGMCC No. 3381的发酵 液稀释100倍，在常年严重发病的田块发现大白菜软腐病的发病率达到时开始喷施发 酵液，以后每间隔7天喷一次，连续喷3次。对于大白菜软腐病的防治效果可达83%，增加大 白菜产量达50%，S卩本发明的简单纯芽孢杆菌(Bacillussimplex)RJGP41 CGMCC No. 3381 能明显抑制大白菜软腐病，并能有效促进大白菜生长、增加大白菜产量。序列表TGAGGCGTAGTTGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAGGTACCAACGTTTACTCTGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAATTTACGACCCGAGCCTTCTTCGTTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACT
TTCGTCCATTGCGGAAAATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCCCATCTATAAGTGACAGCGTAAACCGTCTTTCCATCTTCTCTCATGCGAGAAAAGAACGTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTATAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAATCTCAGGAGCAAGCTCCCATCGATCCGCTCGACTTGCATGTATTCAGATCCAAC
权利要求
一种简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2009年11月2日，保藏号为CGMCC No.3381。
2.根据权利要求1所述的简单纯芽孢杆菌(Bacillussimplex) RJGP41C GMCC No. 3381，其特征在于，是从西藏日喀则市江当乡郭安村的蒲公英根围土中分离，经平板对 峙筛选获得。
3.根据权利要求1所述的简单纯芽孢杆菌(Baci1 Ius simplex) RJGP41 CGMCC No. 3381，其特征在于，为革兰氏阳性细菌，杆状，能产芽孢，能在4°C生长，但不能在50°C生 长，不能耐受PH 5. 7和7% NaCl的培养，接触酶试验、淀粉水解试验、柠檬酸盐利用试验、硝 酸盐还原试验、葡萄糖发酵和酪素试验均为阳性，V-P试验、厌氧生长试验和丙酸盐利用试 验均为阴性。
4.根据权利要求1所述的简单纯芽孢杆菌(Bacillussimplex)RJGP4IC GMCC No. 3381，其特征在于，其16S rDNA的部分核苷酸序列如序列表所示。
5.权利要求1所述的简单纯芽孢杆菌(Bacillussimplex)RJGP41C GMCC No. 3381的 应用方法，其特征在于，包括发酵培养一稀释一喷洒一效果测定四个步骤。
6.根据权利要求5所述的简单纯芽孢杆菌(Bacillussimplex)RJGP41C GMCC No. 3381 的应用方法，其特征在于，所述发酵培养过程中的发酵培养基组成为葡萄糖20g/L，L-谷 氨酸 5g/L, MgSO4 0. 5g/L, KCl 0. 5g/L, KH2PO4 lg/L, Fe2SO4 ·6Η20 0. 15mg/L, MnSO4 ‘ H2O 5. Omg/L，CuSO4 ·5Η20 0. 16mg/L，其余为过滤水，并调节至 pH7. 0。
7.权利要求1 4任意一项的简单纯芽孢杆菌(Bacillussimplex)RJGP41CGMCC No. 3381在抑制大白菜软腐病和促进大白菜生长、增加大白菜产量中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2009年11月2日，保藏号为CGMCC No.3381。本发明的简单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)RJGP41CGMCC No.3381是从西藏日喀则市江当乡郭安村的蒲公英根围土中分离得到的生防芽孢杆菌，可在4℃的条件下生长，该菌株在低温条件下生长良好，有利于发挥其促生和生防作用，其对于大白菜软腐病的防治率高达到83％，同时增加大白菜产量50％。
文档编号A01N63/00GK101928680SQ20091022335
公开日2010年12月29日 申请日期2009年11月19日 优先权日2009年11月19日
发明者伍辉军, 刘芳, 沈波, 薛鹏琦, 高学文 申请人:无锡亚克生物科技有限公司